肺腺癌上皮-间质转化相关标识基因检测的临床意义

王烈 续力云 刘超武 陆畅畅 乐涵波

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内肺癌死亡率居恶性肿瘤之首，5年生存率仅为10%～15%。其中，肺腺癌是绝大多数国家最常见的肺癌组织学亚型。侵犯周围组织和转移到远处器官被认为是恶性肿瘤的特征，也是临床肿瘤治疗失败的主要原因。最近研究表明，不管是侵袭还是转移都依赖于癌细胞获得上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力[1]，EMT的发现为研究肿瘤浸润转移机制及治疗提供了新的方向和靶点。本研究通过检测肺腺癌组织与癌旁组织EMT相关标识基因并进行对照研究，寻找肺腺癌EMT相关分子标志物，为评估肺腺癌预后的新指标及抗肿瘤转移的新靶点提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2013年1月至2015年12月在本院接受手术治疗的117例肺腺癌患者的资料和手术切除的肺组织标本，男41例，女76例；年龄42～75（52.4±9.8）岁；肿瘤最大径 1.0～5.9（2.78±1.91）cm。纳入标准：（1）所有患者均经术后病理确诊；（2）术前未经放化疗治疗；（3）无明显肝、肾功能损害；（4）术后临床病理资料完整，包括性别、年龄、吸烟史、肿块大小、病理类型、转移情况、分期；（5）排除恶性肿瘤史及其他部位原发肿瘤转移病灶。病理分型参照2011年国际肺癌研究学会（IASLC）、美国胸科学会（ATS）和欧洲呼吸学会（ERS）公布的肺腺癌新分类标准，将肺腺癌分为：（1）原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）：局限性，肿瘤细胞沿肺泡壁呈鳞屑样生长，无间质、血管或胸膜浸润的小腺癌（≤3cm）；（2）微浸润腺癌（minimally invasive adenocarcinoma，MIA）：孤立性、以鳞屑样生长方式为主且浸润灶≤0.5cm 的小腺癌（≤3cm）；（3）浸润性腺癌（invasive adenocarcinoma，IA）：含有浸润灶＞0.5cm，可被分为以鳞屑样、腺泡样、乳头状、实性生长方式为主的亚型，推荐新增“微乳头状生长方式”亚型。AIS和MIA通常划分为非浸润性腺癌。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌组织及癌旁组织RNA的抽提及逆转录取 100mg新鲜肺腺癌组织及癌旁组织加入1ml Trizol（Thermo Fisher Scientific，美国），匀浆器进行匀浆；采用试剂盒 RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation（Cat#AM1975,Ambion,美国）提取石蜡组织总RNA。加入300μl氯仿，震荡混匀，室温静置10min；13 000r离心15min，吸取上清液加入等体积异丙醇，混匀；13000r离心10min，弃上清液，加入700μl 75%焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制乙醇；12 000r离心10min，弃上清液，干燥，加入20μl DEPC水溶解RNA。以上述RNA为模板进行反转录，冰上操作，按下述顺序依次加样：2.5μl RNA、1.5μl反转录引物、1μl RNA 酶抑制剂、2μl 10×Buffer、2μl 10nmol/L dNTP、1μl聚合酶，总体积为10μl，在旋涡混旋器上混匀 30s，12 000r离心 30s，放入ABI 7500实时荧光定量 PCR仪（Applied Biosystems，美国）中，程序如下：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃冷却。此反应产物置于-20℃备用。

1.2.2 引物的设计与合成 所有引物设计均来自NCBI、Primer designing tool，且所有引物设计均满足以下条件：（1）引物长度为 17～25bp；（2）GC 含量 45%～55%；（3）熔链温度 60℃左右；（4）A、C、G、T 碱基分布均匀。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本实验以GAPDH为内参基因。GAPDH引物序列：上游引物 5′-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′，下游引物 5′-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3′；钙黏附蛋白 E（E-cadherin）引物序列：上游引物5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′，下游引物5′-AGTAGTCATAGTCCTGGTCTT-3′；波形蛋白（Vimentin）引物序列：上游引物5′-CGGGAGAAATTGCAGGAGGA-3′，下游引物5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′；Snail引物序列：上游引物5′-CAACCCACTCAGATGTCAA-3′，下游引物 5′-CATAGTTAGTCACACCTCGT-3′；Slug引物序列：上游引物5′-GGTCAAGAAGCATTTCAAC-3′，下游引物5′-GGTAATGTGTGGGTCCGA-3′。

1.2.3 实时荧光定量PCR 每个样品设3个复孔，扩增内参 GAPDH、E-cadherin、Vimentin、Snail及 Slug，反应体系如下：5μl Taqman Universal Master MixⅡ（大连宝生物工程有限公司）、0.5μl引物、0.67μl反转录产物、3.83μl DEPC水，总体积为10μl。在旋涡混旋器上振荡混匀5s，12 000r离心10s，放入ABI 7500实时荧光定量PCR仪，以下述条件进行PCR扩增：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 60s，40个循环。每个样本取3个重复孔Ct值的平均数，获得各样本组织ΔCt值（各目的基因Ct值-内参 Ct值），最终获得各样本 2-ΔΔCt值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织与癌旁组织 E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug mRNA表达水平比较 与癌旁组织相比，肺腺癌组织上皮细胞标志物E-cadherin mRNA表达水平下调，差异有统计学意义（P=0.034）；而肺腺癌组织间质标志物Vimentin mRNA表达水平上调，差异有统计学意义（P=0.016）；此外，肺腺癌组织中诱导EMT的转录因子Snail和Slug mRNA表达水平亦上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 1。

图1 E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug mRNA在肺腺癌组织及癌旁组织表达情况（N：癌旁组织；C：癌组织）

2.2 EMT相关标识基因的表达水平与肺腺癌临床病理特征的关系 有淋巴结转移者癌组织E-cadherin mRNA表达水平下调者所占比例高于无淋巴结转移者（16/20 vs 44/97），而 Vimentin、Snail mRNA 表达水平上调者所占比例高于无淋巴结转移者（15/20 vs 40/97，14/20 vs 37/97），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。IA 组 Vimentin mRNA表达水平上调者所占比例高于AIS+MIA组（52/86 vs 12/31），差异有统计学意义（P＜0.05）。含微乳头结构（MPP）成分组癌组织E-cadherin mRNA表达水平下调者所占比例高于不含MPP成分组（27/37 vs 37/80），而 Vimentin、Snail、Slug mRNA 表达水平上调者所占比例高于不含MPP成分组（26/37 vs 39/80，25/37 vs 37/80，28/37 vs 35/80），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌组相比，Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌组癌组织E-cadherin mRNA表达水平下调者所占比例较高（23/39 vs 30/78），而 Vimentin、Snail、Slug mRNA 表达水平上调者所占比例较高（26/39 vs 34/78，24/39 vs 33/78，27/39 vs 38/78），差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

3 讨论

全球范围内肺癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首[2]。近年来，肺腺癌已超过肺鳞状细胞癌，跃居肺癌病理类型首位[3]。目前，针对肺腺癌的研究是肺癌研究领域的重要课题。2011年IASLC、ATS和ERS提出了AIS、MIA和IA的肺腺癌国际多学科新分类标准，为肺腺癌的诊断和治疗提供了重要的指导[4-5]。肿瘤的侵袭和转移被认为是恶性肿瘤的特征，也是临床肿瘤治疗失败的主要原因[6]。因此，寻找有效的预测标志物尤为重要。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程[7]。众多研究表明，通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭等间质表型[8-11]。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[12]。因此本研究分析117例肺腺癌患者的癌组织EMT相关标识基因的表达水平及与临床病理特征的关系，旨在筛选出具有预测肺腺癌侵袭转移的分子标志物及评估肺腺癌预后的新指标。

在EMT过程中，上皮细胞标志物E-cadherin表达水平下调，间质标志物Vimentin表达水平上调，以及诱导EMT的转录因子如Snail、Slug等表达水平亦上调。本研究显示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织E-cadherin mRNA表达水平下调，Vimentin、Snail和Slug mRNA表达水平上调，差异均有统计学意义，本研究结果提示肺腺癌细胞具有间质表型。EMT作为肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，与肿瘤的转移密切相关。本研究进一步分析了EMT相关标识基因的表达与淋巴结转移的关系，结果发现有淋巴结转移的肺腺癌患者，其癌组织E-cadherin mRNA表达水平下调者所占比例较高，而Vimentin、Snail mRNA表达水平上调者所占比例较高，差异均有统计学意义。2011年肺腺癌新分类标准中指出，相对于IA，通常将AIS和MIA划分为非浸润性腺癌。本研究结果表明，IA组Vimentin mRNA表达水平上调者所占比例较高，差异有统计学意义，提示恶性程度更高的肺腺癌病理亚型，其间质表型更明显。在肺腺癌新分类中微乳头状肺腺癌（mi－cropapillary predominant lung adenocarcinoma,MPPAC）以其特殊的病理学特征被单列出定义为一种新的IA组织学亚型，并建议只要该成分所占比例达到5%就应该在诊断中进行描述。MPPAC因其高度的淋巴管侵犯、高淋巴结转移等预后不良的生物学行为，近年来越来越受到临床医师、病理医师及国内外学者的高度重视[13-15]，而关于MPPAC高淋巴结转移的机制及相关因素的研究尚少。本研究以肺腺癌组织是否含MPP成分分为两组，结果发现含MPP成分组癌组织E-cadherin mRNA表达水平下调者所占比例高于不含MPP成分组，而Vimentin、Snail、Slug mRNA表达水平上调者所占比例高于不含MPP成分组，提示EMT可能是MPPAC高淋巴结转移的机制之一。此外，本研究结果亦显示，Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌组织的E-cadherin mRNA表达水平下调者所占比例较高，而Vimentin、Snail、Slug mRNA表达水平上调者所占比例较高，提示晚期肺腺癌具有间质表型，可能是其具有较高恶性程度的重要原因。

综上所述，肺腺癌组织上皮表型相关标识基因表达水平下调，间质表型相关标识基因表达水平下调，尤其是在有淋巴结转移患者、IA患者、含MPP成分者、晚期肺腺癌患者。本研究提示，肺腺癌组织EMT相关标识基因表达水平改变，且与淋巴结转移、病理类型、肿瘤分期相关，提示其可能是评估肺腺癌预后的新指标及肿瘤治疗的新靶点。由于本研究病例数较少，需要扩大样本量进一步深入研究。

表1 EMT相关标识基因的表达水平与肺腺癌临床病理特征的关系（例）

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