HPV E6/E7 mRNA检测对绝经后妇女宫颈病变诊断的价值

王静 徐小敏 兰香 周燕

宫颈癌是除乳腺癌之外的最常见的女性恶性肿瘤。研究表明宫颈癌高发年龄为45～60岁，宫颈癌具有发现晚、预后差、病死率高等特点，已严重威胁绝经后妇女的身心健康[1-2]。目前液基细胞学技术（thinprep cytologic test，TCT）和高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）DNA检测作为宫颈癌筛查的两大手段已广泛应用于临床，且有效降低了宫颈癌的发病率。我国已步入老龄化社会，联合筛查在这一群体中也广泛应用。但由于绝经后妇女雌激素水平低，宫颈萎缩，宫颈细胞发生异型性改变，导致TCT存在一定的假阴性；而HPV DNA检测只能反映病毒感染的类型，不能反映病毒致病的活性。HPV E6/E7 mRNA是HPV病毒持续感染并整合到人体基因组后，致癌活性激活产生的mRNA，代表着癌基因的活动，其检测可以用于评估宫颈癌的发病风险和预后[3-4]。本研究通过对1 032例绝经后妇女的宫颈筛查结果进行分析，以病理诊断为金标准，将HPV E6/E7 mRNA与TCT及HR-HPV DNA进行比较，评价其诊断绝经后妇女宫颈病变的价值，为实现绝经后宫颈病变妇女早诊早治提供帮助。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2015年2月至2017年2月在本院行TCT和HR-HPV DNA联合筛查的绝经后妇女1 032例，年龄 45～70（54.4±6.7）岁，绝经年限 1～25（8.5±6.3）年。排除标准：（1）既往有TCT异常史、HPV感染史及宫颈上皮内瘤变（CIN）史者；（2）有宫颈手术史者；（3）3d内有阴道冲洗及用药者。

1.2 检查方法

1.2.1 TCT、HR-HPV DNA检测 去除宫颈表面黏液和分泌物，采用一次性宫颈刷深入宫颈管，同一方向旋转5～10周，将已经刷取下脱落细胞的宫颈刷放入装有细胞保存液的瓶中进行漂洗。TCT检测结果按2001年伯塞斯达系统（the Bethesda system，TBS）分为正常范围（NILM）、不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞（ASCUS）、非典型鳞状上皮细胞不除外高度病变（ASC-H）、鳞状上皮内低度病变（LSIL）、鳞状上皮内高度病变（HSIL）、鳞状上皮细胞癌（SQCC）、不能明确意义的非典型腺细胞（AGUS）和腺癌（AC）。所有TCT涂片均由2位细胞学医师独立阅片和诊断。本研究以TCT结果≥ASC-US为细胞学阳性，＜ASC-US为细胞学阴性。HRHPV DNA检测的耗材和试剂来自美国Hologic公司，用于检测的细胞来自TCT检测后剩余的细胞保存液。按基因亲缘关系远近将HR-HPV分为A5/A6组、A7组和A9组。A5/A6组检测 HPV51、56和 66型，A7组检测HPV18、39、45、59 和 68 型，A9 组检测 HPV16、31、33、35、52和58型。TCT细胞学阳性者或（和）HR-HPV DNA阳性者均行HPV E6/E7 mRNA检测、阴道镜下宫颈活检和病理诊断。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA检测 检测试剂盒及仪器均为河南新乡科蒂亚生物技术有限公司产品。（1）取样：样本采集方法同TCT、HR-HPV DNA检测。（2）检测方法：经标本裂解、配置检测缓冲液、布板、信号放大、读板5个关键的步骤定量检测HPV E6/E7 mRNA。（3）结果判读：将所读数据转入数据处理软件进行电脑计算，最后

检测结果为拷贝数。本研究以HPV E6/E7 mRNA拷贝数≥1copy/ml为阳性。

1.2.3 阴道镜下宫颈活检和病理诊断 拭去宫颈分泌物后分别行醋酸白及碘试验，对醋酸白及碘试验阴性者常规取3、6、9、12点组织活检，而醋酸白异常及碘试验阳性者在异常区域多点活检。病理诊断标准参照2014年WHO修订的妇女生殖器官肿瘤分类系统[5]。所有标本均由2位病理医师独立阅片和诊断。本研究以病理结果≥HSIL为病理阳性，＜HSIL为病理阴性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示；非正态分布的计量资料以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用 Kruskal-Wallis H 检验；计数资料组间比较采用χ2检验；两组变量的相关性分析采用Spearman秩相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理诊断与TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测结果关系 1 032例绝经后妇女中，TCT细胞学阳性者154例，阳性率14.9%；HR-HPV阳性者210例，阳性率20.3%。其中TCT阳性或（和）HR-HPV DNA阳性者289例，均行HPV E6/E7 mRNA检测、阴道镜下宫颈活检和病理诊断。HPV E6/E7 mRNA阳性者158例，阳性率54.7%。病理诊断阳性者51例，其中HSIL 44例，宫颈癌7例；病理阴性者238例，其中宫颈炎182例，LSIL 56例。病理诊断与 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测结果关系见表1。

表1 病理诊断与TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测结果关系（例）

2.2 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA 对病理分级HSIL以上（HSIL＋）诊断价值的比较 TCT诊断HSIL＋的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均低于 HPV E6/E7 mRNA，差异均有统计学意义（χ2＝31.335、4.862、15.736 和 20.357，均P＜0.05）。HR-HPV DNA诊断HSIL＋的灵敏度、阳性预测值、阴性预测值与HPV E6/E7 mRNA比较，差异均无统计学意义（χ2＝0.793、1.387和 0.004，均 P ＞0.05）；而特异度明显低于HPV E6/E7 mRNA，差异有统计学意义（χ2＝20.794，P＜0.01）。3种检测方法中HPV E6/E7 mRNA的特异度最高，见表2。

表2 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA对HSIL＋诊断价值的比较

2.3 不同病理分级与HPV E6/E7 mRNA表达量的关联性 以宫颈炎、LSIL、HSIL、宫颈癌作为4个不同的病理等级，比较不同病理分级患者HPV E6/E7 mRNA的表达量有无差异，结果发现不同病理分级患者HPV E6/E7 mRNA表达量差异有统计学意义（H＝15.644，P＜0.01）。Spearman秩相关分析显示，病理分级与HPV E6/E7 mRNA 表达量呈正相关（r＝0.401，P＜0.01），见表 4。

表3 不同病理分级患者HPV E6/E7 mRNA表达量分布

3 讨论

宫颈癌是女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。目前研究已经证实宫颈癌的明确病因是HR-HPV的持续感染。HR-HPV的复制与宫颈上皮细胞的分化直接相关，癌基因E6、E7在表面和中间层分化晚期的细胞中表达。HPV感染细胞的过程中，病毒基因组会整合到人基因组，其中癌基因E6、E7与细胞基因产物结合并对它们进行调控，改变细胞生长周期和DNA修复，造成基因组不稳定，从而导致细胞永生化。因此病毒癌基因E6、E7的连续表达是宫颈病变恶性转化的必要条件。由此认为HPV E6/E7 mRNA检测可以识别妇女HPV持续性感染及宫颈病变的风险[6-9]。HPV E6/E7 mRNA检测作为重要的临床辅助诊断技术，近年来已被欧洲生殖器感染和肿瘤研究机构作为重点研究对象[10]。

HPV E6/E7 mRNA检测可检测包括16、18等在内的14种HR-HPV的mRNA，不仅可以降低LSIL的阴道镜活检率，而且对HSIL的诊断及术后随访也有较高的价值[4]。Duvlis等[11]研究结果表明，在诊断HSIL时HPV E6/E7 mRNA检测的特异度及阳性预测值均高于HPV DNA检测。而Ho等[12]也认为，在诊断HSIL时HPV E6/E7 mRNA检测的特异度较好。Pierry等[13]研究发现，不管年龄＞30岁还是＜30岁，HPV E6/E7 mRNA检测诊断HSIL的灵敏度均较高。Ho等[12]、Pierry等[13]及Benevolo等[14]均认为对细胞学为ASC-US及LSIL者，HPV E6/E7 mRNA比HPV DNA更适合作为分流的手段。Benevolo等[14]还指出，对于HPV阳性者，HPV E6/E7 mRNA作为分流的手段优于细胞学。以上研究表明，HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈疾病的诊断中应用广泛，然而其在绝经后妇女这一特殊群体中宫颈疾病筛查的诊断价值目前少见报道。

国际妇产科联盟（FIGO）统计显示，70岁以上的宫颈癌患者占全部宫颈癌患者的12.0%[15]。中国医学科学院肿瘤医院一项研究也表明，≥65岁的宫颈癌患者占同期所有宫颈癌患者的10.8%，且中晚期患者比例高达89.3%[15]。深究原因可能为绝经后妇女由于健康意识差、思想保守等原因，较少参加妇科普查，不易发现早期宫颈病变；且绝经后妇女性生活减少，宫颈癌的早期症状如性生活出血不容易出现。TCT及HR-HPV DNA检测技术作为目前先进的宫颈癌筛查技术，在宫颈癌的防治工作中发挥着非常重要的作用。但是绝经后妇女即使进行TCT及HR-HPV DNA检测，假阳性率及假阴性率较非绝经期妇女明显增高，且重复性差，从而导致部分妇女延误或过度治疗。主要有以下3方面原因：（1）绝经后妇女雌激素水平降低,下生殖道萎缩，宫颈鳞状上皮层变薄，宫颈鳞-柱交界区常常上移，鳞-柱交界处细胞取样困难，临床往往难以取到满意的细胞量，这直接影响了TCT制片质量及 HPV DNA提取；（2）绝经后妇女的TCT往往提示萎缩性细胞学改变，这与高度上皮内病变、不成熟化生等的鉴别有一定的困难；（3）在宫颈癌筛查工作中，筛查人员的专业水平、经验、诊断水平及对诊断标准的把握等均影响筛查效果[16]。本研究中TCT的灵敏度（0.29）、特异度（0.42）均较低，而 HR-HPV 灵敏度（0.90）较高，但特异度（0.31）较低，这与上述结论一致。

绝经后妇女的 HPV病毒负荷量较高。研究发现HPV感染在人群中呈U型或S型分布，第1个高峰在25～35岁，第2个高峰在＞55岁年龄段[17]，且感染HRHPV妇女的年龄越大，越容易发生严重的宫颈病变[18]。本研究中7例宫颈癌患者中有6例年龄在55岁以上，全部感染HR-HPV，与以上研究结果一致。

本研究发现3种检测方法中TCT的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值均较低，故笔者不推荐在绝经后妇女中单独使用TCT作为宫颈癌的筛查手段。HPV E6/E7 mRNA在3种检测方法中特异度最高，与TCT及HR-HPV DNA比较差异均有统计学意义，可见在绝经后妇女中HPV E6/E7 mRNA检测较TCT及HR-HPV DNA更精准，能更为准确地筛选出高危人群。但HPV E6/E7 mRNA灵敏度为0.84，漏诊率为15.7%，因此，笔者也不建议其单独应用于绝经后妇女宫颈癌的筛查。近年来，多项研究表明在普通人群中HPV E6/E7 mRNA联合细胞学检测可提高宫颈癌早期筛查的准确性[19-21]；而作为细胞学异常的分流手段，HPV E6/E7 mRNA特异度明显高于HR-HPV DNA[21]。结合本研究，笔者认为在绝经后妇女中也可将HPV E6/E7 mRNA与细胞学联合检测或将其作为细胞学或HR-HPV DNA检测异常患者的分流手段。

本研究还发现，绝经后妇女HPV E6/E7 mRNA表达量越高，严重病变可能性越大，这与Ratnam等[22]及王璐等[23]的研究一致。这说明对于高表达量的患者要引起警惕。然而具体表达量的高低是否有明确的数据截点，有待于以后大样本的研究明确。

综上所述，绝经后妇女宫颈病变有其特殊性，应寻找适合其特点的筛查方案。HPV E6/E7 mRNA检测对绝经后妇女HSIL+病变的筛查具有较高特异度，可与TCT联合可用于宫颈癌初筛，也对宫颈癌常规筛查细胞学异常或HR-HPV阳性具有分流意义，有助于减轻绝经后妇女的心理负担，避免临床上的过度治疗。且HPV E6/E7 mRNA表达量随着宫颈病变严重级别的升高而增加，对预测绝经后妇女高级别CIN及宫颈癌的风险有重要的临床价值。

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