蛋鸡Ⅰ群腺病毒湖北株的分离与分子鉴定

墨海峡，陈雪姣，周 鹏，江 涛，欧阳金旭，杨玉莹，汪招雄

（1.长江大学动物科学学院，荆州434025；2.湖北省荆州市畜牧兽医局，荆州434020）

禽腺病毒（Fowl Adenovirus，FAV）根据群特异性抗原的不同分为三个群，Ⅰ群禽腺病毒（FAV1）具有共同的群抗原，包括传统的禽腺病毒及其他禽类分离物，共12个血清型，代表株为鸡胚致死孤儿病毒（Chicken embryo lethal orphan virus，CELOV），属于血清1型腺病毒。该群病毒在鸡、鸭和鹅体内普遍存在，能使鸡群呈现隐性感染，可作为继发病原与其它病原共同作用家禽，并能垂直传播，污染鸡胚。鸡Ⅱ群禽腺病毒可以引起火鸡出血性肠炎（hemorrhagic enteritis，HE）、雏鸡大理石脾病（marble spleen disease，MSDA），这些病毒具有一种与Ⅰ群病毒不同群的抗原，自然界中也存在着无病原性的这类腺病毒并可作免疫预防；Ⅲ群腺病毒，即与减蛋综合征（egg drop syndrome，EDS）有关的一类病毒，可从鸡、鸭、鹅体内分离获得，致病性差异很大，部分含有Ⅰ群腺病毒的共同抗原。

“心包积水—肝炎综合症”（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus type 4，FAV 4）引起的一种家禽疾病。典型症状是3～5周龄肉鸡、蛋鸡青年鸡、黄鸡及麻鸡突然死亡，并伴随有心包积水和肝炎。1963年Helmboldt 等在美国的肉用仔鸡中首次发现该病[1-3]，之后墨西哥、加拿大、日本、澳大利亚等许多国家均报道有本病的发生[4,5]。1976 年，我国台湾首次报道了该病，随后辽宁省、吉林省、湖南省、江苏省和河南省等相继也发现该病的存在[6,7]。

本试验通过采集疑似“心包积水—肝炎综合症”蛋鸡肝脏，研磨无菌处理后接种SPF鸡胚分离病毒，提取DNA，经过对FAVhexon基因序列分析，确定分离的病毒为Ⅰ群4型禽腺病毒，通过动物回归试验，了解该病发病的临床症状和病理变化。

1 材料和方法

1.1 材料 疑似“心包积水-肝炎综合症”病死蛋鸡来源于湖北省荆州市、宜昌市和荆门市规模化蛋鸡场。

1.2 试剂 DNA提取试剂盒、dNTP、ExTaq酶、DNA Marker、pMD19-T载体购于TaKaRa公司。

1.3 病毒分离 无菌采集病鸡肝脏，按1∶5的比例加入灭菌生理盐水研磨成悬液，反复冻融3次后，5000 ×g离心20 min，上清用0.22 μm微孔滤器过滤，吸取0.2 mL滤液接种9～11日龄SPF鸡胚；弃24 h内死胚，取接种后48 ～72 h未死亡的鸡胚放于4℃冰箱保存5 h，收取尿囊液，盲传3代后，收集尿囊液-20℃保存备用。

1.4 细菌的分离 无菌取肝脏及心包积液，在麦康凯琼脂平板和血平板进行细菌分离，培养12 h，观察结果。

1.5 病毒基因组的提取 用TaKaRa试剂盒提取病料中病毒 DNA和RNA，按照试剂盒提供的方法操作。

1.6 PCR反应 根据GenBank 上已发表的1群腺病毒hexon基因序列，设计3对引物。H1：5'-TGGA CATGGGGGCGACCTA-3'；H2：5'-AAGGGATT GACGTTGTCCA-3'；H3：5'-AACGTCAACCCC TTCAACCACC-3'，H4：5'-TTGCCTGTGGCG AAAGGCG-3'；FAV4-F：5'-CGGGATCCA TGTCAGCAGTAGGCGATT-3'，FAV4-R：5'-CCCAAGCTTTTACACGGCGTTGCT-3'。其中引物H1、H2扩增片段长度为1219 bp；引物H3、H4扩增的片段长度为1350 bp；引物FAV4-F、FAV4-R扩增片段长度为295 bp。引物用灭菌ddH2O稀释到20 μmol/mL，-20℃保存备用。PCR反应体系为25 μL：DNA模板2 μL、10×PCR buffer（含Mg+）2.5 μL、dNTP 2 μL、ExTaq酶 0.25 μL、上下游引物各1 μL、补充ddH2O至25 μL。反应程序：95℃预变性5 min；然后95℃变性1 min、56℃退火2 min、72℃延伸90 s、30个循环；72延伸10 min。1.7 PCR产物回收，连接及测序 经琼脂糖凝胶检测，切下与目的条带大小一致的片段，用试剂盒回收纯化。取回收产物与pMD-19T载体16℃连接8 h，转化 DH5α感受态细菌，涂布到选择性Amp平板，过夜培养后挑取单个菌落接种5 mL 含Amp的LB液体培养基，摇床转速200 r/min，37℃培养3～5 h，对菌液进行PCR鉴定，并送武汉擎科创新生物有限公司测序 。

1.8 序列比较 采用 DNAStar 软件系统进行将序列与禽腺病毒各群hexon序列进行分析，通过hexon基因序列区分血清型。参考的禽腺病毒信息，见表1。

表1 禽腺病毒信息表Table 1 The information of the cited sequences

1.9 动物回归实验 将40只30日龄健康雏鸡随机分为两组，每组20只。A组为试验组，每只颈部皮下注射病毒尿囊液0.2 mL，B组为对照组，每只接种0.2 mL无菌生理盐水。鸡群感染后连续观察15 d，记录饮水、采食和死亡情况，并将试验组未死亡鸡和对照组鸡均解剖观察病理变化；试验组死亡鸡和未死亡鸡以及对照组鸡肝脏处理后，用PCR检测FAV4。

2 结果

2.1 眼观病理变化 临床发病鸡心脏上有黄色果冻状心包积液（图1A），肝脏呈现土黄色和出血点（图1B、E），肾脏肿大、苍白，脾脏肿大，腺胃在乳头基底部，靠肌胃交界处出血（图1C、D、F）。

2.2 细菌分离 将病料接种于麦康凯琼脂平板和血平板分离培养24 h左右后，均未观察到任何细菌生长，可以排除细菌感染。

图1 不同器官病理变化Fig. 1 The pathological changes of different organs

2.3 PCR 扩增结果及产物的克隆 对提取的DNA进行PCR扩增，均扩增出相应的片段，与预期的目的片段大小相符，H1、H2引物扩增结果见图2A，H3、H4引物扩增结果见图2B，FAV-4引物扩增结果见图2C。

图2 不同引物PCR扩增结果Fig.2 The result of PCR ampli fi cation products by different primers

2.4 基因序列分析 3株来自不同鸡场病毒的基因同源率为100%。将分离毒株核苷酸序列与其他参考株病毒核苷酸序列（见表1）进行比较。结果如图3所示，分离的病毒与Ⅰ群禽腺病毒同源性相对较高，与2016年湖北武汉分离的HB1510株同源性最高，达到99.8%，与2003年加拿大分离到的Ⅰ群9血清型A-2A株的核苷酸序列相似性为69.6%，与鹅腺病毒4型P29株的同源性是64.2%，与人腺病毒C的同源性是45.9%；分离的毒株与Ⅱ群禽腺病毒2008年以色列分离出来的鸡出血性肠炎病毒同源性是43.3%，与2012年匈牙利分离得到的火鸡出血性肠炎病毒D90/2株同源性为78.6%，与美国2008年分离得到的同源性最高是43.1%；分离的毒株和Ⅲ群禽腺病毒的减蛋综合征病毒（GenBank登录号：Y09598）的同源率为43.8%。

遗传进化树显示，本实验分离株与Ⅰ群FAV亲缘关系最近，特别是与血清4型更接近。分离株与选取的禽腺病毒4血清型参考毒株在同一分支上，与Ⅰ群的其他血清型在不同分支，Ⅱ群和Ⅲ群单独在一个分支上，结果见图4。

2.5 动物回归实验

2.5.1 临床症状和病理变化 试验组在第3 d，2只鸡发病并出现急性死亡，部分鸡只精神沉郁、食欲减退，个别出现拉黄绿色粪便。在第4 d和第5 d出现死亡高峰期，15 d内死亡率达到60%；死亡鸡只心脏有心包积液；肝脏出血，部分出现土黄色肾脏肿大；肾脏肿胀、有出血点，输尿管尿酸盐沉积；肠道出血、腺胃出血。对照组没有出现发病症状和死亡现象，心脏和肝脏正常。

2.5.2 PCR检测结果 将试验组死亡鸡和未死亡鸡，以及对照组鸡均采集肝脏抽提DNA，用FAV-4引物进行PCR扩增鉴定，试验组死亡鸡和试验组未死亡鸡均呈阳性，而对照组鸡PCR扩增阴性。

2.6 病理组织学观察结果 攻毒组急性死亡鸡只病理切片如图5A所示，肝脏发生明显脂肪变性，同时有颗粒变性和水泡变性，无坏死现象，部分淤血出现；典型心包积水肝炎综合征的死亡鸡只病理切片如图5B所示，肝脏发生坏死，核浓缩，甚至部分消失，淤血明显；攻毒组未死亡鸡只如5C图所示，肝脏发生变性；5D图为对照组鸡只肝脏。

3 讨论

鸡心包积水-肝炎综合征的病理特征是心包积液和肝炎，同时心包积液也是禽类的一种疾病。通过病毒分离，可以用电子显微镜确定其与禽腺病毒有关。心包积液的病毒属于FAV4型，并且是高致病性的。从肝脏和鸡胚盲传3代后的尿囊液中均检测到FAV4，但是心包积液中未检测出。与2015年王婉等[8]试验结果不太一样，能直接用肝脏组织分离到病毒。

在之前的报道中，典型症状一般是3～5周龄肉鸡、蛋鸡青年鸡、黄鸡及麻鸡。在该病例中，从湖北地区40、60和240日龄的蛋鸡中均能分离出禽腺病毒，并且出现大面积死亡现象，说明该病毒目前广泛发生并且出现发病日龄扩大的趋势。

将病死鸡与动物攻毒组发病鸡解剖病理比较分析，都有黄色果冻状心包积液产生，心脏出现黄染；肝脏上有出血点，有些肝脏变成土黄色。送检病料中肾脏、脾脏病变比较明显，肾脏肿大，有现尿酸盐沉积，脾脏肿大明显，送检病料中腺胃乳头基底部靠近肌胃交界处有出血点，个别腿肌出血。而攻毒组肾脏肿大不明显，有尿酸盐沉积，脾脏无明显病变，没有肿大现象，而在肌胃腺、胃和腿肌均无出血点。

图3 分离株与参考毒株核苷酸序列分析Fig. 3 Nucleotide sequence analysis between isolates and reference strains

图4 分离株与参考毒株生物进化树分析Fig. 4 The analysis evolutionary tree between isolates and reference strains

图5 病理组织图（10×40）Fig.5 The pathological chart（10×40）

近年来，越来越多FAdV不同血清型毒株引起的疾病在很多国家有报道[9-11]，有些FAdV血清型毒株对鸡具有高致病性，引起很大的经济损失[12-15]。在中国，从2012年以来疫情呈上升趋势，大多数情况下导致3～5周龄肉鸡发病，偶尔发生于10～20周龄母鸡。在这些爆发的死亡率范围从轻微的增加到超过30%。

目前，在该病毒的基因中，hexon基因是研究范围最广的，具有群与型的特异性，包括4个可变环L1～L4结构，不同毒株的hexon基因序列均已公布，本实验中，用hexon基因序列设计的引物进行PCR扩增与克隆，测序片段包括了该基因的全序列，分离株与Ⅰ群FAV同源率最高，亲缘关系最近，特别是血清4型。而与Ⅱ群、Ⅲ群亲缘关系最远，属于不同的进化支，本研究为进一步研究心包积水-肝炎综合症奠定坚实的基础。

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