非洲猪瘟疫苗研究进展

王西西，陈 青，吴映彤，郭晓宇，李金祥

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 北京 100193；2.北京农学院 农业部都市农业(北方) 重点实验室，北京102206；3.中国农业科学院，北京 100081）

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一种核质巨DNA病毒，在病毒分类中隶属于DNA病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，为该科唯一成员，且是目前唯一已知的虫媒DNA病毒[1]。ASFV病毒粒子具有双层囊膜结构，基因组为线性双链DNA分子，不同毒株之间基因组大小存在一定差异，总体介于170～190 kb之间；ASFV基因组可编码150多个开放阅读框，成熟病毒粒子中含有50种以上结构蛋白[2]。ASFV主要通过巨胞饮以及网格蛋白介导的胞吞作用感染宿主单核巨噬细胞系统[3,4]，根据毒力的不同可将其分为高致病性、中等毒力、低毒力以及感染无临床症状毒株等。非洲猪瘟（african swine fever，ASF）临床病例中以高致病性病毒感染最为常见，其发病率和死亡率可达100%[5,6]。因此，OIE将ASF列为必须报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。

20世纪中前期，ASF主要在非洲大陆猪群中传播，1957年之后传入欧洲多个国家，包括葡萄牙、西班牙、意大利和法国等，给上述国家的养猪业造成巨大损失。到20世纪90年代中期，除了仍在意大利的撒丁岛流行，ASF已从欧洲消除[5,6]。2007年，ASF在高加索地区和俄罗斯暴发并持续流行，疫情延至东欧多国，再次突显了ASF对全球养猪业的巨大威胁。由于ASFV强毒株基因组可编码多种蛋白质，用以干扰宿主的天然免疫系统，从而抑制和逃避宿主的免疫应答反应，为自身的增殖、扩散创造有利条件，使得ASF至今尚无有效疫苗用于防治，因此疫苗的研发对控制该病具有重大意义。针对ASFV疫苗的研究始于上世纪60年代，由于ASFV拥有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制，为疫苗研发工作带来诸多困难。

随着现代分子生物学、免疫学和疫苗学技术快速发展，以及对病毒与宿主免疫系统互作机制的深入研究，ASF疫苗研制取得了较大进展。本文对主要的ASF灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗以及基因工程亚单位疫苗等研究进展进行概述，以期为ASF疫苗开发提供参考。

1 灭活疫苗

传统病毒疫苗可通过病毒灭活和病毒致弱两种方法进行制备。灭活疫苗通过物理或化学手段将病原灭活，使其失去感染能力，但保留其抗原性。迄今为止，采用多种传统方法制备的ASF灭活疫苗均不能对强毒攻击提供有效的免疫保护[7,8]，包括病毒接种肺泡巨噬细胞以及感染脾组织后匀浆制备的灭活疫苗。虽然用ASF灭活疫苗免疫后可产生高效价的抗体，但很难检测到中和抗体的存在。Blome等[9]研究表明，即使用新型佐剂PolygenTM或Emulsigen(®)-D等与ASFV灭活抗原进行配伍，免疫动物后能够诱导产生ASFV特异性抗体，但仍未能提高疫苗的免疫保护效力。这可能是由于产生的ASFV特异性抗体并不具有中和活性，提示细胞免疫在ASF疫苗免疫保护中起重要作用。此外，Gómez-Puertas等[10]研究人员也证实在细胞传代过程中，低代次和高代次的ASFV毒株对中和抗体的敏感性存在差异。鉴于现有研究结果，采用传统方法研制有效的ASF灭活疫苗困难很大。

2 减毒活疫苗

根据减毒活疫苗毒株来源不同，可将ASF减毒活疫苗毒株分为三类：传代致弱毒株、天然致弱毒株和重组致弱毒株。减毒活疫苗能够诱导强烈持久的免疫应答，但生物安全是其使用的主要限制因素。采用分子生物学手段，可通过基因重组、靶向缺失以及一次性侵染技术来增强减毒活疫苗的安全性。

2.1 传代致弱毒株 ASFV可经过猪骨髓来源细胞、Vero和COS-1等细胞系传代致弱。传代过程中，ASFV致病力逐渐下降，同时病毒免疫原性和稳定性也随之下降。在西班牙和葡萄牙，使用传代致弱毒株免疫动物后产生了灾难性的后果，免疫动物呈现出肺炎、流产和死亡等副作用，在田间多次感染和异源强毒株存在的条件下，许多免疫动物呈现ASF慢性感染临床症状。因此，传代致弱毒株的致病性导致此类疫苗的开发一度受阻。Krug等[11]利用分离株ASFV-G在Vero细胞中进行传代培养，随着传代次数的增加，ASFV-G在Vero细胞中的复制能力增强，同时在猪原代巨噬细胞中的复制能力下降，病毒毒力逐渐衰减，在传至第110代时完全丧失。家猪接种完全致弱的ASFV-G毒株后并未获得相应保护力，以抵抗母本病毒的攻击[11]，表明传代致弱的ASFV安全性较差且很难提供较好免疫保护。

2.2 天然致弱毒株 采用天然致弱ASFV毒株OURT88/3 或NH/P68免疫动物后，能诱导产生对同源强毒株的攻毒保护，依据实验动物和攻毒毒株的不同，保护率介于66%～100%[12-15]。研究表明，病毒特异性抗体以及CD8+T细胞在免疫保护中均起重要作用，且OURT88/3毒株产生的免疫保护与病毒特异性IFN-γ产生细胞呈正相关性。采用NH/P68免疫后，猪对高毒力ASFV/L60感染抵抗力增强[13]。以OURT88/3免疫并用致病性OURT88/1毒株进行加强免疫后，可诱导机体产生针对ASFV I型不同分离毒株的交叉保护[12]，表明研制具有交叉保护的ASFV疫苗是可能的。然而，天然致弱毒株免疫动物后可造成诸多副反应，包括肺炎、流产、死亡等，免疫NH/P68毒株后25%～47%的猪呈现慢性感染[13]；免疫OURT88/3后可导致发热、关节肿胀等症状[15]。总之，天然致弱毒株导致的诸多副反应以及存在散毒的可能性等生物安全隐患限制了其在实际生产中的进一步应用。

2.3 重组致弱毒株 采用分子生物学方法，敲除病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因，可降低病毒毒力或增加机体对病毒的免疫应答，研制比传统弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程减毒活疫苗。研究表明，一些ASFV毒株在缺失单个或多个毒力基因/或免疫抑制基因后，如TK（K196R）、9GL（B119L）、CD2v（EP402R）、DP148R、NL（DP71L）、UK（DP96R）和多基因家族360和505（MGF 360/505），缺失毒株接种宿主毒力减弱且可诱导产生针对同源母本毒株或异源毒株的特异性免疫保护（表1）[16-19]。ASFV编码多种蛋白以干扰宿主免疫系统，已报道的病毒免疫逃逸相关基因包括A238L、A179L、A224L、 DP71L、MGF360/505、I329L、K205R、D96R、DP148R、A276R、D96R和EP153R等，其编码蛋白抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素和ISGs的产生，调控细胞凋亡、蛋白合成和自噬等多种信号通路[19-23]。由于这些蛋白质可干扰宿主免疫应答，从ASFV强毒株中缺失上述基因有助于增强宿主免疫应答（表1）。

安全性和有效性是影响ASF 弱毒活疫苗田间应用的重要因素，安全性和有效性与病毒毒株、免疫或感染剂量、病毒接种途径以及接种动物密切相关。因此，致弱毒株保护性的强弱、是否有毒力残留和是否导致持续感染是弱毒活毒株能否成为候选疫苗毒株的重要决定因素。因此，还需要进一步研究以确定适合的缺失靶基因及其组合，以研制可诱导保护性免疫反应且没有相应副作用的ASFV弱毒活疫苗。

表1 减毒活疫苗研究进展Table 1 Progress towards the development of ASFV live attenuated vaccines

3 病毒活载体疫苗

已有研究表明，细胞免疫和体液免疫在抗ASFV感染中发挥作用[24-26]。有学者将ASFV保护性抗原重组入腺病毒或痘病毒载体，以期获得更好的细胞免疫和CTL反应。Lokhandwala等[27]将ASFV p32、p54、p72和pp62基因分别重组入人腺病毒Ad5载体中进行“鸡尾酒”式免疫，获得了良好的抗原特异性CTL反应；之后他们又将ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR 、B438L和K205RA104R共7个ASFV抗原基因，重组入复制缺陷型腺病毒载体，通过“鸡尾酒”式混合免疫后能够诱导强烈体液免疫反应和细胞免疫应答[28]。上述研究仍需通过攻毒保护试验，进一步验证病毒活载体疫苗在ASF疫苗开发中的可行性。

4 核酸疫苗

ASF核酸疫苗的研究刚刚起步，通过将编码病毒主要抗原的基因克隆入真核表达载体后，直接导入机体内，在宿主细胞内完成转录翻译后产生抗原蛋白，从而同时激活体液免疫和细胞免疫应答。Argilaguet等将ASFV p72、p30和p54基因克隆入真核表达载体，制备ASF DNA疫苗，但该DNA疫苗免疫猪后并不能够提供攻毒保护[29,30]。同组科研人员将ASFV p30和p54基因与猪白细胞抗原II的特异性抗体单链可变区基因在真核表达载体中融合表达；接种ASF DNA疫苗后，在没有诱导产生可检测水平ASFV抗体的情况下，能够使部分动物获得攻毒免疫保护，表明细胞免疫在ASFV疫苗的免疫中起重要作用[30]。最新研究表明，根据一个或两个ASFV抗原构建的DNA疫苗并不能诱导较高免疫保护，而免疫ASFV基因组DNA质粒表达文库能够提供60%的保护力，说明有待于发掘更多保护性抗原，以提高核酸疫苗的保护水平[31]。

5 亚单位疫苗

ASF亚单位疫苗只包含特定的病毒抗原，需通过合适抗原传递系统免疫动物。鉴定可以引起强烈的免疫应答的抗原及其表位，有助于开发有效的ASFV亚单位疫苗。研究表明，针对病毒p30蛋白的抗体在细胞水平抑制超过95%的ASFV内化，p72和p54的抗体能够抑制病毒吸附，表明这些蛋白在ASFV感染中发挥作用。用重组p30或p54蛋白免疫猪后可以诱导中和抗体的产生，但不能提供针对急性ASF感染的保护[32]；相比之下，同时免疫 p30和p54蛋白或两种蛋白的嵌合体可以提供部分保护[32,33]。用杆状病毒表达系统制备的ASFV结构蛋白p72、p30和p54等，以蛋白复合物作为抗原免疫动物后仍不能提供有效的免疫攻毒保护[32-34]，说明仅仅依靠上述抗原刺激产生的中和抗体很难获得理想的免疫保护效果。在另一组研究中，Lopera-Madrid等[35]分别以人源293 (HEK) 细胞表达的ASFV B646L (p72)、E183L (p54)和O61R (p12)亚单位抗原，或者痘苗病毒载体疫苗进行首免和加强免疫，获得较好的体液免疫和细胞免疫水平。因此，需要研究鉴定更多的ASFV保护性抗原、开发新型免疫佐剂以及采用DNA首免蛋白质加强免疫策略，以提高ASF基因工程亚单位疫苗的免疫效力。

6 展望

2017年初至今，俄罗斯境内多个州发生ASF疫情，其中，伊尔库茨克州、鄂木斯克州发生地点距离我国边境较近，因此对于我国疫情防控而言，除做好风险防范工作以外，研发安全有效ASF疫苗也迫在眉睫。过去的几十年中，对ASF疫苗的研究虽取得了较大进展，包括评估细胞传代致弱、自然致弱、基因缺失等ASFV疫苗，但是所有努力都未能研制出可应用于实际生产的疫苗。通过基因重组技术，获得安全、高效ASFV减毒活疫苗仍是ASFV疫苗开发的首选策略。然而，仍有一些问题需要考虑，包括弱毒疫苗在体内的安全性研究，以及鉴定并开发适合弱毒活疫苗生产的细胞系等[36]。研发可鉴别野毒感染和疫苗免疫的ASF亚单位疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗、以及复制缺陷型疫苗[37]也是研发ASFV疫苗的重要策略，尤其是在没有疫病流行地区的使用。与减毒活疫苗相比，这些疫苗的生物安全性有所提高，但鉴定病毒保护性抗原，有效的递送机制以及高效的免疫佐剂[38,39]都需要长期的研究和探索。

87 国外畜牧学-猪与禽 4-361 月刊 96.00 潘雪男 021-62209279 上海市闵行区北翟路2901号 201106 shzyq2005@126.com

[1] Dixon L K, Chapman D A, Netherton C L,et al. African swine fever virus replication and genomics [J]. Virus Res,2013, 173(1)： 3-14.

[2] Tulman E R, Delhon G A, Ku B K,et al.African swine fever virus [J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2009, 328：43-87.

[3] Galindo I, Cuesta-Geijo M A, Hlavova K,et al. African swine fever virus infects macrophages, the natural host cells, via clathrin- and cholesterol-dependent endocytosis[J]. Virus Res, 2015, 200： 45-55.

[4] Andres G. African swine fever virus gets undressed： new insights on the entry pathway [J]. J Virol, 2017, 91(4).

[5] Sánchez-Vizca í no J M, Mur L, Mar tí nez-López B.African swine fever (ASF)： five years around Europe[J].Vet Microbiol, 2013, 165(1-2)： 45-50.

[6] Mar tí nez-López B, Perez A M, Feliziani F,et al.Evaluation of the risk factors contributing to the African swine fever occurrence in Sardinia, Italy[J]. Front Microbiol, 2015, 6： 314.

[7] Forman A J, Wardley R C, Wilkinson P J. The immunological response of pigs and guinea pigs to antigens of African swine fever virus [J]. Arch Virol,1982, 74(2-3)： 91-100.

[8] Mebus C A. African swine fever [J]. Adv Virus Res,1988, 35： 251-269.

[9] Blome S, Gabriel C, Beer M. Modern adjuvants do not enhance the efficacy of an inactivated African swine fever virus vaccine preparation [J]. Vaccine, 2014, 32(31)：3879-3882.

[10] Gómez-Puertas P, Oviedo J M, Rodrı́guez F,et al.Neutralization susceptibility of African swine fever virus is dependent on the phospholipid composition of viral particles[J]. Virology, 1997, 228(2)： 180-189.

[11] Krug P W, Holinka L G, O'Donnell V,et al. The progressive adaptation of a georgian isolate of African swine fever virus to vero cells leads to a gradual attenuation of virulence in swine corresponding to major modifications of the viral genome [J]. J Virol, 2015,89(4)： 2324-2332.

[12] Mulumba-Mfumu L K, Goatley L C, Saegerman C,et al.Immunization of african indigenous pigs with attenuated genotype i african swine fever virus OURT88/3 induces protection against challenge with virulent strains of genotype I [J]. Transbound Emerg Dis, 2016, 63(5)：e323-327.

[13] Leitao A, Cartaxeiro C, Coelho R,et al. The nonhaemadsorbing African swine fever virus isolate ASFV/NH/P68 provides a model for defining the protective anti-virus immune response [J]. J Gen Virol, 2001, 82(Pt 3)： 513-523.

[14] Sánchez-Cordón P J, Chapman D, Jabbar T,et al.Different routes and doses influence protection in pigs immunised with the naturally attenuated African swine fever virus isolate OURT88/3 [J]. Antiviral Res, 2017,138： 1-8.

[15] King K, Chapman D, Argilaguet J M,et al. Protection of European domestic pigs from virulent African isolates of African swine fever virus by experimental immunisation[J]. Vaccine, 2011, 29(28)： 4593-4600.

[16] Abrams C C, Goatley L, Fishbourne E,et al. Deletion of virulence associated genes from attenuated African swine fever virus isolate OUR T88/3 decreases its ability to protect against challenge with virulent virus[J]. Virology,2013, 443(1)： 99-105.

[17] O'Donnell V, Risatti G R, Holinka L G,et al.Simultaneous deletion of the 9GL and UK genes from the african swine fever virus georgia 2007 isolate offers increased safety and protection against homologous challenge[J]. J Virol, 2016, 91(1).

[18] O'Donnell V, Holinka L G, Sanford B,et al. African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of 9GL and MGF360/505 genes is highly attenuated in swine but does not confer protection against parental virus challenge [J]. Virus Res, 2016, 221： 8-14.

[19] Arias M, De l La Torre, Dixon L,et al. Approaches and perspectives for development of african swine fever virus vaccines[J]. Vaccines(Basel), 2017, 5(4). pii： E35.

[20] Reis A L, Netherton C, Dixon L K,et al.Unraveling the armor of a killer： evasion of host defenses by african swine fever virus[J]. J Virol, 2017, 91(6). pii： e02338-16.

[21] Zakaryan H, Revilla Y. African swine fever virus： current state and future perspectives in vaccine and antiviral research[J]. Vet microbiol, 2016, 185： 15-19.

[22] Rock D L. Challenges for African swine fever vaccine development—“… perhaps the end of the beginning.”[J]. Vet Microbiol, 2017, 206： 52-58.

[23] Malogolovkin A, Burmakina G, Tulman E R,et al.African swine fever virus CD2v and C-type lectin gene loci mediate serological specificity[J]. J Gen Virol, 2015,96(Pt4)： 866-873.

[24] Oura C A, Denyer M S, Takamatsu H,et al.In vivodepletion of CD8+T lymphocytes abrogates protective immunity to African swine fever virus [J]. J Gen Virol,2005, 86(Pt 9)： 2445-2450.

[25] Takamatsu H H, Denyer M S, Lacasta A,et al. Cellular immunity in ASFV responses [J]. Virus Res, 2013,173(1)： 110-121.

[26] Escribano J M, Galindo I, Alonso C. Antibody-mediated neutralization of African swine fever virus： myths and facts[J]. Virus Res, 2013, 173(1)：101-109.

[27] Lokhandwala S, Waghela S D, Bray J,et al. Induction of Robust Immune Responses in Swine by Using a Cocktail of Adenovirus-Vectored African Swine Fever Virus Antigens [J]. Clin Vaccine Immunol, 2016, 23(11)： 888-900.

[28] Lokhandwala S, Waghela S D, Bray J,et al. Adenovirusvectored novel African swine fever virus antigens elicit robust immune responses in swine[J]. PLoS One, 2017,12(5)： eo177007.

[29] Argilaguet J M, Pérez-Martin E, Nofrarias M,et al. DNA vaccination partially protects against African swine fever virus lethal challenge in the absence of antibodies [J].PLoS One, 2012, 7(9)： e40942.

[30] Argilaguet J M, Pérez-Martin E, Gallardo C,et al.Enhancing DNA immunization by targeting ASFV antigens to SLA-II bearing cells [J]. Vaccine, 2011,29(33)： 5379-5385.

[31] Lacasta A, Ballester M, Monteagudo P L,et al. Expression library immunization can confer protection against lethal challenge with African swine fever virus[J]. J Virol, 2014,88(22)： 13322-13332.

[32] Gómez-Puertas P, Rodriguez F, Oviedo J M,et al. The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response [J]. Virology, 1998, 243(2)： 461-471.

[33] Barderas M G, Rodriguez F, Gómez-Puertas P,et al.Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant African swine fever virus proteins[J]. Arch Virol, 2001, 146(9)： 1681-1691.

[34] Neilan J G, Zsak L, Lu Z,et al. Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30, p54, and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection[J].Virology, 2004, 319(2)： 337-342.

[35] Lopera-Madrid J, Osorio J E, He Y,et al. Safety and immunogenicity of mammalian cell derived and Modified Vaccinia Ankara vectored African swine fever subunit antigens in swine[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2017,185： 20-33.

[36] Arias M, de la Torre A, Dixon L,et al. Approaches and perspectives for development of African swine fever virus vaccines[J]. Vaccines(Basel), 2017, 5(4). Pii： E35.

[37] Si L, Xu H, Zhou X,et al. Generation of influenza A viruses as live but replication-incompetent virus vaccines[J]. Science, 2016, 354(6316)： 1170-1173.

[38] 李学钊, 洪炀, 王治仓, 等. 免疫佐剂研究进展及前景展望[J]. 中国动物传染病学报, 2014(4)： 81-86.

[39] 赵占中, 薛飞群. DNA疫苗的免疫佐剂[J]. 中国动物传染病学报, 2010, 18(2)：79-86.