辣椒制品中苏丹红Ⅰ快速检测的方法研究

汪开银，熊晓辉，游京晶，陆利霞，卢一辰，陈　斌

(1.国家轻工业食品质量监督检测南京站，江苏 南京 211800；2.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800)

苏丹红(Sudan)是一类亲脂性偶氮化合物，属于人工合成的红色工业染料，根据结构不同分为苏丹红Ⅰ(C16H12N2O)、苏丹红Ⅱ(C18H16N2O)、苏丹红Ⅲ(C22H16N4O)和苏丹红Ⅳ(C24H20N4O)[1]。由于苏丹红具有染红其他食品的功能且价格低廉，一些厂家把苏丹红添加到辣椒酱、辣椒油、辣椒粉和红心鸭蛋等食品中，以达到食品长期保持鲜红、不易褪色的目的。大量研究表明，短期内摄入大量苏丹红会导致死亡，长期食用苏丹红引发体内蓄积性毒性，致使机体器官损伤或基因突变，继而诱发癌症[1-3]。多项苏丹红的“三致”实验发现，苏丹红化学成分中含有一种萘的化合物，其具有偶氮结构，在体内分解形成芳香胺化合物，使动物致癌，同时对人类也显现出较高的致癌风险[4]。多年前发生的苏丹红事件给中国社会和民众带了很大冲击，2006年，我国发布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第一批)》中苏丹红被列为了严禁添加的非食用物质。目前，国际癌症研究机构(IARC)已将苏丹红Ⅰ归类为三级致癌物和遗传毒性物质，欧盟也发布了辣椒制品里禁止非法添加苏丹红染料的禁令[5]。

目前，国内外关于苏丹红的快速检测技术主要包括薄层层析比色法、酶联免疫技术、表面增强拉曼技术和胶体金免疫层析技术[6-9]。此4种方法各有其优缺点：其中，薄层层析比色法不需要使用复杂仪器，可实现快速、简单测定，但样品处理较为复杂，且灵敏度低；酶联免疫技术具有检测速度快、成本低和目标选择性强等优点，但其操作过程较为繁琐，结果重复性较差，且需要使用酶标仪进行检测，该仪器价格昂贵且不便于携带，难以满足现场检测的要求；表面增强拉曼光谱技术虽可实现快速、简单测定，但易受基体影响；胶体金免疫层析技术具有快速、灵敏、简单、低成本和无需大型仪器等优点，被广泛应用于食品中残留物的分析，联合国粮农组织已向许多国家推荐该项技术，美国化学会将免疫分析技术与色谱技术共同列为农、兽药残留分析的主要技术[10-12]。目前我国市场上已有利用此技术的商品化试剂盒，但是，这些商品化试剂盒因为受食品介质影响较大，特别是辣椒制品中色素和油脂的干扰，导致检测灵敏度低，无法满足要求。因此，本研究中，笔者选择胶体金免疫层析技术作为苏丹红Ⅰ的快速检测技术，对辣椒制品的前处理方法进行改进和优化，使其适于在快速检测中推广使用。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1样品来源

辣椒酱、辣椒油和辣椒粉均购自南京本地超市，经GB/T 19681—2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》测试，本底不含苏丹红类化合物。

1.1.2主要试剂和仪器

乙腈、无水MgSO4、正己烷、二氯甲烷、NaOH、无水乙醇(AR)，国药集团化学试剂有限公司；固相萃取柱(CNW Poly-sery MIP-SDR，200 mg/3 mL)，上海安谱实验科技股份有限公司；苏丹红Ⅰ胶体金免疫层析试剂盒(内含金标微孔和试纸条)，深圳市易瑞生物技术有限公司；苏丹红Ⅰ标准品(≥99.0%)，德国DR公司。

QL-866型涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；DC-24型氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司；HH-2型水浴锅，国华电器有限公司。

1.2　方法与检测原理

本文中选择的胶体金免疫层析技术采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苏丹红 Ⅰ 经过前处理提取后，可以与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测线(T线)上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线(C线)颜色深浅比较，对样品中苏丹红 Ⅰ 进行定性判定。

1.3　实验步骤

1.3.1前处理方法

1)直接提取法

称取样品2 g于15 mL离心管中，加入10 mL正己烷，涡旋振荡后离心。转移全部上清液于10 mL离心管中，吹干后加入400 μL 25%(体积分数)乙醇溶液，涡旋混匀后，待测定。

2)固相萃取柱方法

称取样品2 g于15 mL离心管中，加入正己烷提取液，涡旋振荡后离心。将全部上清液加入到固相萃取柱中，流出液弃去。再加入正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用二氯甲烷洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。加入400 μL 25%乙醇溶液，涡旋混合后，待测定。

3)皂化法

称取样品2 g于15 mL离心管中，加入正己烷提取，涡旋振荡后离心。转移全部上清液于10 mL离心管中，吹干后加入NaOH溶液，涡旋混匀后置于80 ℃水浴皂化。再加入正己烷，涡旋萃取后离心，转移上清液于新的10 mL离心管中，加入无水MgSO4，涡旋振荡后离心，转移上清液于10 mL离心管中吹干。加入400 μL 25%乙醇溶液，涡旋混合后，待测定。

1.3.2试剂条测定方法

吸取200 μL待测液于金标微孔中，抽吸10次使混合均匀，室温温育5 min，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育8 min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定：检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色深或者检测线(T线)颜色与控制线(C线)颜色相当，表明样品中苏丹红Ⅰ低于方法检测限，判定为阴性；检测线(T线)不显色或检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色浅，表明样品中苏丹红Ⅰ的含量高于方法检测限，判定为阳性；控制线(C线)不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

1.3.3实验方法学研究

1)产品方法性能指标的测定

称取以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉为代表的空白基质样品，添加苏丹红Ⅰ标准溶液制成添加水平为0、5、10 和20 μg/kg的盲样样品各50份，共计600份样品。按上述前处理方法和测定方法进行测定。

2)交叉反应

称取以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉为代表的空白基质样品，分别添加苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、苋菜红、胭脂红、诱惑红、赤藓红、新红、日落黄、柠檬黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22、靛蓝和亮蓝标准溶液，制备成添加水平为0、10、20、50、100、200、500和1 000 μg/kg的系列样品，按上述前处理方法和测定方法进行测定，考察试剂盒与上述化合物的交叉反应。交叉反应率(CR)的计算见式(1)。

CR=(苏丹红Ⅰ最低检出限/其他物质最低检出限)×100%

(1)

3)与参比方法一致性

称取以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉为代表的空白基质样品，苏丹红Ⅰ添加量为10 μg/kg 的盲样样品各40份。其中20份按上述前处理方法和测定方法进行测定，另外20份以GB/T 19681—2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》作为参比方法，对方法一致性进行研究。

4)快检方法验证

根据方法验证要求，南京工业大学、中国农业科学院油料作物研究所和山东省食品药品检验研究院3家方法验证单位对食品中苏丹红Ⅰ的快速检测方法进行方法学验证。实验评价以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉作为空白基质，经仪器方法确证为阴性。以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉作为空白基质制成的盲样，盲样中苏丹红Ⅰ含量分别为0、5、10和20 μg/kg 4个添加水平的盲样样品，每个添加水平平行制备20份，每种基质每家验证单位盲样样品80份，每家验证单位共计240份盲样样品，3家验证机构共计720份加盲样样品，以盲样形式寄送给3家方法验证单位，辣椒酱和辣椒油用固相萃取法进行前处理，辣椒粉用皂化法进行前处理，并用胶体金试剂条方法进行测定。

2　结果与讨论

2.1　提取试剂的优化

苏丹红不溶于水，易溶于有机试剂，所以选择最常用的3种有机试剂正己烷、丙酮和乙腈作为苏丹红提取试剂进行优化。

选取加标为500 μg/kg的辣椒酱样品，通过直接提取法：有机试剂提取、离心、取上清液吹干，复溶液复溶检测，结果见图1。由图1可知：提取效果最好的是正己烷，其次是乙腈，丙酮提取效果相对较差，所以选择正己烷作为提取试剂。

图1　　　　不同提取试剂的检测结果Fig.1　　　　Detection results of different extraction reagents

2.2　提取方法的比较

称取以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉为代表的空白基质样品，添加苏丹红Ⅰ标准溶液，分别制成添加水平为0、5、10、20、50、100、200 、500和1 000 μg/kg 的加标样品，分别用直接提取法、固相萃取法和皂化法进行前处理，胶体金试剂条进行检测，以检出阳性结果最低值作为其检测限，结果见表1。

表1　前处理方法的检测限比较

表1结果显示：直接提取法在检测辣椒酱、辣椒油和辣椒粉时，检测限较高，无法满足检测要求；固相萃取法适用于辣椒酱和辣椒油的检测，检测限可以达到10 μg/kg；皂化法适用于辣椒粉的检测，检测限可以达到10 μg/kg。图2为辣椒酱、辣椒油和辣椒粉中苏丹红Ⅰ添加量为10 μg/kg的检测结果。

图2　　　　苏丹红Ⅰ添加量为10 μg/kg的检测结果Fig.2　　　　Detection results of 10 μg/kg Sudan red Ⅰ addition dose

2.3　产品方法性能指标的测定

称取以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉为代表的空白基质样品，添加苏丹红Ⅰ标准溶液制成添加水平为0 、5、10 和20 μg/kg的盲样样品各50份，共计600份样品。按照上述前处理方法进行测定。进一步对方法性能进行评价，结果如表2～4所示。

表2　方法性能指标计算表(辣椒酱)

表3　方法性能指标计算表(辣椒油)

表4　方法性能指标计算表(辣椒粉)

对于辣椒酱、辣椒油和辣椒粉基质阳性样品来说，均检出100个阳性结果，假阴性率均为0；对于阴性样品来说，也均检出100个阴性结果，假阳性率为0。同时，辣椒酱、辣椒油和辣椒粉基质样品灵敏度均为100%，特异性均为100。

2.4　交叉反应结果

当苏丹红Ⅲ添加水平高至500 μg/kg时，苏丹红Ⅰ试剂盒检测均检出阳性，表明本方法试剂盒与苏丹红Ⅲ有交叉反应，且交叉反应率为2%。

苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苋菜红、胭脂红、诱惑红、赤藓红、新红、日落黄、柠檬黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22、靛蓝和亮蓝添加水平至1 000 μg/kg时，苏丹红 Ⅰ 试剂盒检测均检出阴性，表明本方法试剂盒均与上述试剂无交叉反应。

2.5　与参比方法一致性分析

在检测限浓度水平(10 μg/kg)时，胶体金试剂盒方法测定结果与参比方法检测结果完全一致，具体结果见表5。由表5可知，胶体金试剂盒方法结果均与参比方法一致，符合方法一致性要求。

表5　与参比方法一致性分析情况

2.6　验证结果与汇总

3家方法验证单位的验证结果见表6～8，其中，甲为南京工业大学，乙为中国农业科学院油料作物研究所，丙为山东省食品药品检验研究院。由表6～8可知：以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉作为空白基质时，本方法的特异性均为87.5%～100%，灵敏度均为100%，假阳性率均≤12.5%，假阴性率均为0，符合食药监科便函[2017]43号《食品快速检测方法评价技术规范》的技术要求。

表6　方法性能指标计算表(辣椒酱)

表7　方法性能指标计算表(辣椒油)

注：丙结果中的一个阳性样品检测结果为失效。

3　结论

选用辣椒制品中的辣椒酱、辣椒油和辣椒粉作为空白基质，对苏丹红Ⅰ胶体金快速检测试剂盒产品进行方法学研究。研究表明：直接提取法在检测辣椒酱、辣椒油和辣椒粉时，检测限较高，无法满足检测要求；固相萃取法适用于辣椒酱和辣椒油的检测，检测限可以达到10 μg/kg；皂化法适用于辣椒粉的检测，检测限可以达到10 μg/kg。该方法的灵敏度为100%，特异性为87.5%～100%，假阳性率为12.5%，假阴性率为0，上述性能指标均符合食药监科便函[2017]43号《食品快速检测方法评价技术规范》的技术要求。交叉反应率结果显示苏丹红Ⅲ与本方法试剂盒有交叉反应，且交叉反应率为2%；苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苋菜红、胭脂红、诱惑红、赤藓红、新红、日落黄、柠檬黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22、靛蓝和亮蓝与本方法试剂盒均无交叉反应。同时，与参比方法进行一致性分析比较时，结果表明与参比方法阳性确证比例在 95% 的置信区间内没有统计学差异或完全一致。因此本方法适用于辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测。

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