鸡蛋中呋喃唑酮代谢物金标试纸条快速分析

董　雪，王丽雯，袁　建，伦丽丽，张　勋

(1.南京财经大学 食品科学与工程学院 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心 粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210023；2.江苏美正生物科技有限公司，江苏 无锡 214000)

硝基呋喃类药物是硝基糠醛的Shiff碱衍生物，被广泛使用在医疗和兽医行业，用于治疗溃疡和胃肠道感染，同时对家禽、猪、兔子和鱼类等宿主上的各种寄生虫和病原微生物感染具有治疗和预防作用。由于呋喃唑酮是一种具有遗传毒性的致畸致癌物质[1-2]，在动物饲养过程中使用呋喃唑酮会导致动物健康受到损害，动物体内残留的呋喃唑酮代谢物通过食物链的传递最终损害人体健康。呋喃唑酮不仅会破坏人肝癌细胞DNA的正常生长，导致细胞周期停滞在S期[3]，同时会在体内快速代谢为3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)，导致血浆中母体化合物的浓度水平急剧降低。硝基呋喃类药物在机体中代谢后，代谢产物在蛋白组织中累积，并能长期稳定存在[4]。

因此，自欧盟1995年禁止使用呋喃唑酮后，到目前为止许多国家也已经禁止使用硝基呋喃。2002年，中国农业部规定：禁止在动物饲料和饮水中添加硝基呋喃[5]。然而，在许多国家的畜禽、水产养殖场中，仍然存在将氯霉素、孔雀石绿、硝基呋喃和甲硝唑等作为饲料添加剂非法使用的情况，其中，呋喃唑酮是使用最广泛的呋喃药物。因此，检测养殖场和周边环境中的呋喃唑酮残留对于监控呋喃唑酮的使用和保护环境具有十分重要的意义。基于呋喃唑酮的代谢特点和结构特性，目前大部分检测方法是通过检测与蛋白质等组织结合的AOZ从而间接实现对呋喃唑酮的监测。由于AOZ分子量只有102，没有紫外吸收，并且在色谱柱中会很快洗脱，一般仪器检测方法需要预处理，首先将其与2-硝基苯甲醛形成稳定的化合物NPAOZ。目前，高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法[6-10]等检测方法都已经实现对呋喃唑酮代谢物的检测和分析。然而，色谱检测方法耗费时间长、成本高、需要昂贵的仪器，并且不适合用于高通量的筛选。

免疫学快速检测技术具有灵敏度高、成本低、需求样本量少等优点，可以应用于动物组织、尿液等样品，进行快速和高通量筛查，广泛用于小分子、核酸和蛋白质等物质的快速检测[11-16]。很多研究者报道了基于抗原抗体生物反应检测呋喃唑酮代谢物的方法[17-20]。酶联免疫吸附测定法(ELISA)虽然灵敏度比较高，但是操作步骤较繁琐，需要酶标仪等设备，不适合现场快速检测。目前国内市场上的硝基呋喃类代谢产物的胶体金试纸条具有检测快的优点，但检测限一般在1 μg/kg左右，与仪器检测方法相比，仍有一定的差异。

本文中，笔者基于呋喃唑酮代谢物AOZ单克隆抗体，通过胶体金标记技术制备胶体金快速检测试纸条，建立基质添加标准曲线，以期实现对鸡蛋中痕量呋喃唑酮代谢物的高灵敏、高特异性检测，通过肉眼即可实现结果的判别。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

含呋喃唑酮代谢物的阳性鸡蛋样品以及阴性样本、呋喃唑酮代谢物小鼠单克隆抗体AOZ-Ab、呋喃唑酮代谢物牛血清白蛋白偶联物AOZ-BSA，江苏美正生物科技有限公司；呋喃妥因及其代谢1-氨基-2-内酰脲(AHD)、呋喃西林及其代谢物氨基脲(SEM)、呋喃唑酮及其代谢物3-氨基-2-恶唑烷基酮(AOZ)、呋喃它酮及其代谢5-吗啉甲基-3氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)，德国Dr.E公司；邻硝基苯甲醛(2-NBA)、牛血清白蛋白(BSA)，Sigma 公司；HRP-羊抗鼠二抗、羊抗鼠二抗，Jackson 公司；其他试剂均为市售分析纯试剂。

1.2　主要仪器

电磁加热搅拌套式恒温器、搅拌子、除湿机、封口机、ZQ3500型数控快速斩切机、CT300型数控裁条机、HM3030型 XYZ三维划膜喷金仪，上海金标公司；MZ6000型台式试纸条扫描读数仪、自动旋转仪、热封机，江苏美正生物科技有限公司；Sartorius CN140型硝酸纤维素膜、H5015型特厚吸水垫、Ahlstrom 8964型样品垫、PVC背板等，上海杰一生物公司。

1.3　方法

1.3.1AOZ单克隆抗体标记金纳米粒子制备

取一定体积的金纳米粒子溶液(20 nm)加入K2CO3调节pH至8.2，同时将AOZ-Ab用0.002 mol/L、pH 8.2 硼酸盐缓冲液稀释到0.2 mg/mL。然后取15 mL无菌离心管，分别加入10 mL金溶液，在加入60、80、100和120 μg的抗体溶液后，盖紧盖子用手轻轻颠倒晃动并摇匀。在自动旋转仪上混匀30 min。取100 g/L BSA 水溶液500 μL，缓慢滴加至金纳米溶液中，继续在自动旋转仪上混匀2 h。然后8 000 r/min离心30 min，除去多余的抗体和BSA，用金标抗体洗涤液(含有100 g/L BSA，5 g/L PEG 6000的0.01 mol/L PBS)洗涤1次，最后加入1/10倍原始体积的金标垂悬液(含有20 g/L BSA、5 g/L PEG 6000和25 g/L海藻糖的pH 8.0的0.01 mol/L Tris-HCl溶液)将金标抗体浓缩10倍，放4 ℃冰箱备用。

1.3.2样本前处理与检测步骤

按照文献[21]方法对鸡蛋进行前处理，并做适当修改。首先将鸡蛋样本用均质器搅拌成均一的蛋液，然后称取(4±0.1)g蛋液于50 mL离心管中；分别用移液器加入5 mL 1 mol/L盐酸和400 μL 0.05 mol/L邻硝基苯甲醛(乙腈)溶液，在旋涡振荡器上剧烈振荡2 min；然后将50 mL离心管置于65 ℃水浴锅中孵育30 min。孵育结束后用移液器分别加入1 mL 1 mol/L K2HPO4和1 mL 2 mol/L NaOH溶液，剧烈振荡60 s混匀；然后用移液器加入5 mL乙酸乙酯，剧烈振荡2 min；然后置于离心机中4 000 r/min离心5 min后，移取上层液体2 mL于5 mL离心管中，置于氮吹仪中60 ℃下吹干。用移液器加入2 mL正己烷于吹干的离心管中，剧烈振荡1 min，至吹干固体油状物完全溶解后，再加入400 μL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PBS)，剧烈振荡1 min，静置分层或于离心机中4 000 r/min离心1 min，用移液器取下层溶液100 μL(勿取到上层正己烷)于微孔试剂中缓慢抽吸多次，至检测样品与微孔试剂充分混匀；使用计时器，开始计时；室温(20～25 ℃)孵育3 min后，将试纸条插入微孔中，使之充分浸入溶液中，然后开始计时；室温(20～25 ℃)反应5 min后，取出试纸条并判读结果。

1.3.3胶体金试纸条的制备

将金标抗体浓缩溶液用金标垂悬液分别按照10、12.5、15、20和25倍进行稀释，并按50 μL/孔体积加到96孔酶标板中冷冻干燥。冻干程序：-35 ℃降温60 min，维持200 min；预抽真空到10 Pa；-20 ℃ 升温60 min，维持200 min，真空度10 Pa；-5 ℃升温60 min，维持200 min，真空度10 Pa；25 ℃升温60 min，维持200 min，真空度10 Pa。金标溶液由液体变成干燥的饼状，等冷冻干燥完毕后取出，用热封机封口保存。

把呋喃唑酮牛血清白蛋白偶联物代谢物(AOZK-BSA)用PBS稀释到2.0、1.5、1.0、0.5和0.25 mg/mL，并在划膜喷金仪上喷到硝酸纤维素膜上作为检测区域，形成检测线(T线)。将羊抗鼠二抗稀释到0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL，喷到硝酸纤维素膜后作为控制区域，形成控制线(C线)，放在烘箱中过夜干燥待用。将已经喷上检测抗原和羊抗鼠二抗的硝酸纤维素膜(NC膜)、样品垫和吸水垫依次叠加组装成试纸条(图1)，并用数控裁条机斩切成4 mm宽度的试纸条，干燥密封保存。

图1　　　　胶体金标试纸条示意Fig.1　　　　Structure of the colloidal gold test strip

1.3.4胶体金试纸条的优化

取200 μL 0.01 mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液，加到含有冷冻干燥的金标抗体微孔中，用枪吹打均匀，室温反应3 min。将试纸条样品垫端插入微孔溶液中。样品溶液在层析作用下，从试纸条的样品垫端，依次通过硝酸纤维素膜的检测区域和控制区域向吸水垫一端流动，微孔中溶液由于抗原抗体的特异性相互作用，引起纳米金粒子的聚集，进而显示出C线和T线，5 min后将C线和T线显色都明显的检测抗原和金标抗体浓度配对记录下来，进行抑制测试。

将AOZ添加到阴性鸡蛋样品后，按前处理步骤进行衍生化处理，测试试纸条的灵敏度。AOZ添加的梯度为0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.3和0.5 μg/kg。按照上述方法进行试纸条的检测，利用读数仪对检测区域(T线)和控制区域的灰度值进行扫描和记录。检测样品的检测线区域灰度值高于控制区域的灰度值时，可以判断样品为阴性；添加有AOZ样品的试纸条检测结果中，检测线区域灰度值低于控制区域的灰度值时，可以判断样品为阳性。

同时通过肉眼对试纸条的检测结果进行判断，阳性检测结果的最低检测限(LOD值)定义：肉眼观察T线颜色明显比控制区域的灰度值弱时的检测物浓度。当样品中AOZ的含量高于某一数值时，检测线消失，只有控制线显色，此为试纸条消线含量(cut-off值)。

1.3.5方法特异性检测

按照AOZ胶体金试纸条方法分别对呋喃唑酮、呋喃妥因及其代谢物1-氨基-2-内酰脲(AHD)、呋喃西林及其代谢物氨基脲(SEM)，呋喃它酮及其代谢物5-吗啉甲基-3氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)和邻硝基苯甲醛(2-NBA)进行检测。

1.3.6与仪器方法比对

市场上不同品牌、不同摊位购买的鸡蛋，总计50批次，分别使用胶体金方法和仪器检测方法(农业部781公告方法)进行检测，并将结果进行比对。

2　结果与讨论

2.1　呋喃唑酮单克隆抗体标记金纳米粒子表征

本实验参考Frens柠檬酸三钠还原法合成金粒子，改变加入的柠檬酸酸三钠的量来控制所合成的纳米离子的粒径大小[22]。金纳米粒子的透射电镜(TEM)照片和紫外-可见光吸收图见图2和3。金纳米粒子的直径在20 nm左右，最大吸收峰在520 nm附近。胶体金的显色原理是抗体标记的金纳米粒子在硝酸纤维素膜上通过层析作用流动，并在检测区域和检测抗原相互作用而引起金纳米粒子堆积显色。一般来说，金纳米粒子溶液的外观呈现透明的酒红色。当使用呋喃唑酮代谢物单克隆抗体使用量大于80 μg时，标记好金纳米粒子后颜色是暗红色，没有聚集现象。同时紫外扫描也显示没有聚集。为使得方法具有最佳灵敏度，选择每毫升金纳米粒子8 μg抗体标记量。

图2　　　　金纳米粒子的电镜照片Fig.2　　　　TEM image of the gold nanoparticle

图3　　　　金纳米粒子的紫外-可见光吸收Fig.3　　　　Ultraviolet-visible absorption of the gold nanoparticle

2.2　呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条检测方法的建立

通过读数仪进行灰度分析，可以减少肉眼对颜色深浅进行判断而引起的差异。通过对检测抗原和金标抗体浓度配对结果进行灰度分析，选择检测区和控制线区域的灰度值信号在1 000左右的检测条件，并且在此条件下，通过肉眼观察C线颜色稍微比T线浅，并具有最佳检测灵敏度。最终优化结果表明：将金标抗体浓缩溶液用金标垂悬液稀释到20倍；把AOZ-BSA用PBS稀释到1 mg/mL，作为检测区域形成T线；将羊抗鼠二抗稀释到0.2 mg/mL，作为控制区域形成C线。

在鸡蛋中添加呋喃唑酮代谢物标准品，并进行衍生化处理，处理后的溶液进行试纸条检测，结果见图4。由图4可知：通过肉眼判断，当标准品含量为0.02 μg/kg时，检测区域的T线颜色明显浅于控制区域的颜色；当样品中添加标准品含量高于0.5 μg/kg时，检测线消失，只有控制线显色；因此，呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条消线含量(cut off 值)为0.5 μg/kg，肉眼最低检测限0.02 μg/kg。目前，国内硝基呋喃代谢物的胶体金检测方法，其检测限主要在1.0 μg/kg，判读方法为比色方法，与仪器方法检测限存在较大的差距，同时比色方法对判读的要求较高，容易出现争议。而本研究建立的胶体金试纸条检测方法能够实现对呋喃唑酮代谢物的高灵敏度检测。

图4　　　　胶体金试纸条法检测鸡蛋中呋喃唑酮代谢物Fig.4　　　　Detection of AOZ in eggs by the colloidal gold test strip

2.3　呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条检测方法特异性分析

按照同样的方法对呋喃唑酮、呋喃妥因及其代谢物1-氨基-2-内酰脲(AHD)，呋喃西林及其代谢物氨基脲(SEM)，呋喃它酮及其代谢物5-吗啉甲基-3氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)和邻硝基苯甲醛(2-NBA)，结果见图5。从图5中可以看出，50 ng/mL的标准品均不能够检测出阳性结果，说明试纸条对AOZ的检测具有高度特异性，此体系中的相关化学物质的交叉反应率小于0.1%。

图5　　　　胶体金试纸条检测方法特异性分析Fig.5　　　　Specificity of the colloidal gold test strip

2.4　仪器方法的比对

通过分别使用胶体金方法和仪器方法对购买的30批鸡蛋进行检测。仪器检测共发现阳性结果6例，含量均高于0.5 μg/kg；而这4种鸡蛋，通过胶体金方法检测均显示阳性结果。说明研发的胶体金方法和仪器方法具有一致性。

3　结论

本实验基于高特异性、高灵敏度的呋喃唑酮代谢物小鼠单克隆抗体建立胶体金快速检测技术，实现对鸡蛋中呋喃唑酮代谢物AOZ的高灵敏度检测，其检测限可以达到仪器方法的检测限，因此可以避免快速检测方法漏检的发生。胶体金检测方法成本低、灵敏度高、操作简单且方便，可以用于现场硝基呋喃类违禁药品的检测，对于现场的快检具有重要意义。

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