慕萨莱思酿造过程中有机酸含量的变化

◎ 王子坤，贾清华，李雅雯，韩爱芝，黄 英，奚 倩，吴 鑫，侯旭杰

（1.塔里木大学分析测试中心，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；3.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

有机酸在整个葡萄酒的酿造过程起到十分重要的作用，有机酸的存在会改善葡萄酒的口感，但是含量要适中。总酸可以作为衡量葡萄酒品质的一个重要指标，用pH值来表示，酸度值位于2.9～3.9。随着科学技术的发展，以及西方营养学的进步，研究学者发现了葡萄酒中更多的特性以及独特用处。葡萄酒中对人体有益的成分有上百种，包含有机酸类、酚类、维生素类，虽某些成分含量不高，但极易被人体的吸收利用。酒中的有机酸类物质，能体现出葡萄原料的特征以及成品酒的风味特点，也可以反映酿造工艺的特点。酒石酸又被称为葡萄酸，化学名称2,3-羟基丁二酸，成品酒中葡萄酸的含量为1.5～2.5 g·L-1，作为酒中含量比较高的一种酸，会对酒的颜色产生一定影响[1-4]。自然界水果中都存在苹果酸，随着酒酿造过程进行，酒精发酵结束后便会进入苹果酸-乳酸发酵阶段。苹乳发酵降低了生酒的生青味和酸涩度、粗糙度和色度等，使酒体更加柔和、圆润。乳酸产生于葡萄酒发酵第二阶段，它的浓度直接影响着pH值，在人体中也产生乳酸，但是浓度不会上升的太高。丙酮酸是一种重要的中间代谢产物，在糖酵解发生时磷酸烯醇丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下生成丙酮酸，对葡萄酒的口感影响较低，因为在发酵过程被分解所以含量低。在植物动物体内都有草酸的存在。植物中的草酸多以草酸钙而存在，在成品酒中几乎没有，对口感没有很大影响。甲酸酸性很强，可以刺激皮肤。乙酸、乙醇可以形成香味物质乙酸乙酯，如果发酵后期没有很好的隔绝空气，或者有可能被杂菌感染，乙酸浓度增大，说明酒已经变质。琥珀酸又叫丁二酸，在酵母发酵的过程中，经三羧酸循环均会代谢产生琥珀酸；苹乳发酵形成琥珀酸；谷氨酸的转化也形成琥珀酸[5-9]。葡萄果实中均含有柠檬酸。在TCA循环中柠檬酸仅是中间产物。

1 试验材料

1.1 材料与试剂

实验室自酿慕萨莱思在A（原汁）、B（浓缩）、C（陈酿）三个阶段进行采样，成品酒（D）来自新疆阿瓦提刀郎慕萨莱思有限公司，阿瓦提慕萨莱思（葡萄）。

标准品：草酸、DL-酒石酸、甲酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、一水柠檬酸、D-苹果酸、琥珀酸（Dr.Ehrenstorfer GmbH）。 丙 酮 酸 [Alfa Aesar（China）Chemicals Co. Ltd]，抗坏血酸（天津市风船化学试剂），十三烷酸甲酯（上海安谱）。标准品纯度均在99%以上。

1.2 仪器设备

WATERS 2695高效液相色谱仪（美国Waters仪器公司），GL-20 G-2高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），BP211D电子分析天平（北京赛多利思有限公司），SB-25-12DT超声波清洗机（宁波新芝生物公司），100～1 000 μL微量移液枪（上海安谱），Trace1300 ISQ气相色谱-质谱联用仪（美国Thermo公司），DB-5MS UI（30×0.250×0.25）气相色谱柱（美国Agilent公司），N-1100-W旋转蒸发仪、CCA-1111冷却水循环装置、DC-12H恒温水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）。

1.3 试验方法[10-11]

1.3.1 定性分析

使用气质联用仪自带的谱库进行检索，分析结果，参考文献、查询相关资料共同进行定性。

（1）气相色谱条件。DB-Wax毛细管柱（30 mm×0.25 μm）；载气He（99.999%）；恒流，柱流速1.0 mL·min-1；分流比25∶1；进样量2.0 μL；进样口温度250 ℃；升温程序：初温40 ℃，保持2 min，以7 ℃·min-1升至 150 ℃，保持 5 min，再以 6 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min。

（2）质谱条件。电子电离源：电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；传输管线温度280 ℃；溶剂延迟时间3.5 min；扫描模式：全扫描；质量扫描范围m/z 29～500。

1.3.2 试剂准备

利用旋转蒸发仪将甲醇中的水分蒸干，温度40 ℃，制成无水甲醇，将50 mL浓硫酸加入到350 mL的无水甲醇中，加入的同时冷水浴，并使用玻璃棒不断搅拌。使用旋转蒸发仪将二氯甲烷中的水分蒸干，温度35 ℃，制成无水CH2Cl2。

在标准天平室称取标准品，称取0.025 g十三烷酸甲酯，用甲醇溶解标准品，并用胶头滴管定容至25 mL，得到1 mg·mL-1内标标准储备液，放于冰箱4 ℃备用。

1.3.3 样品前处理

取约40 g样品加入250 mL三角瓶，加入1 mg·mL-1十三烷酸甲酯内标储备液500 μL，再加入60 mL 12.5%的硫酸-甲醇溶液，摇匀后放入于35 ℃培养箱，130 r·min-1，恒温30 h。拿出反应液然后倒入漏斗过滤，过滤完成后使用重蒸好的二氯甲烷60 mL进行萃取，萃取完成加入饱和氯化钠洗涤2次，洗涤完成加入10 g无水硫酸钠，除去水分，然后密封置于-20 ℃冰箱静置过夜。除去干燥剂后用高纯度氮气吹扫，浓缩，液体转移到5 mL容量瓶中，用重新蒸馏过的二氯甲烷溶液定容，取定容溶液2.0 μL进行GC-MS分析。

1.3.4 有机酸的HPLC定量分析

（1）标准溶液。称取酒石酸、苹果酸、一水柠檬酸、抗坏血酸、琥珀酸、草酸各0.05 g，用超滤水定容至5 mL；甲酸、乙酸、乳酸、丙酮酸各20 μL，定容至2 mL，浓度分别为10 mg·mL-1，此液为标准储备液。

（2）标准使用液。分别取标准使用液0.02、0.1、0.2、0.5 mL和1.0 mL，加入0.2 mL的1 mol·L-1的磷酸，用超滤水稀释至10 mL，混匀。样品上机体积10 μL，在210 nm位置处测量峰高或峰面积，有机酸的浓度大小作为横坐标，相应的色谱峰的峰面积作为纵坐标，并且使用软件做出标准曲线，得出回归方程。

1.3.5 样液的制备

将放在冰箱的样品进行解冻，取15～20 mL的样品倒入离心管，设定离心机10 000 r·min-1时间5 min，拿出离心管得到上清液5 mL，小心转入准备好的10 mL容量瓶，加入配制好的0.2 mL的磷酸溶液（1 mol·L-1），稀释至10 mL使用超纯水，滤膜使用0.45 μm过滤，得到滤液以便供分析。

2 结果与分析

2.1 GC-MS定性实验数据

样品经过甲酯化衍生以后，二氯甲烷作为溶剂而后进行萃取，萃取液经过浓缩，然后用GC-MS仪器进行定性分析，得到GC-MS总离子流图，据质谱总离子流图，同时通过仪器自带的数据库，进行检索，也可以人工手动解析，从而对目标峰进行定性，确定有机酸的种类。样品中各个有机酸的种类、保留时间及相似度见表1，各阶段GC-MS图谱如图1～3所示。

表1 样品中各个有机酸的种类、保留时间及相似度表

图1 原汁阶段GC-MS图谱图

图2 浓缩阶段GC-MS图谱图

图3 陈酿阶段GC-MS图谱图

通过表1可以准确地确定有机酸的种类，进行比较准确的定性，相关系数都达到了800以上，通过GC-MS进行定性，结果准确可靠。

2.2 11种有机酸标准曲线的建立

为了更准确的计算样品中有机酸的含量，本试验采用外标法对不同时间段样品中的有机酸进行含量分析。绘制了各有机酸的峰面积-浓度曲线，计算11种有机酸的回归方程和相关系数，并给出了其线性范围，绘制的标准曲线及相关系数，如表2所示。

表2 11种有机酸的保留时间与线性回归方程表

11种标准品色谱图如图4所示，通过色谱图可以发现，11种标准品可以很好地分离，所采用的色谱条件可以满足样品分析需要。

图4 11种有机酸混标色谱图

2.3 标准品保留时间的重现性分析

为了验证方法保留时间的重现性，对11种标准品进行了6次重现性试验，并计算标准品6次保留时间（min），结果如表3所示。

表3 标准品混标的重现性实验结果表

从表3得知，各种有机酸保留时间相对标准偏差在0.021%～0.598%，说明仪器系统与实验方法可靠，样品重现性好，可以满足样品分析需要。

2.4 HPLC法对样品中有机酸含量的分析

样品中的有机酸含量见表4。

表4 样品中含有的有机酸含量表

通过前期预实验可知，当样品未完全溶解时，样品中的有机酸的含量会比完全溶解时的含量要多。所以，为得到准确的实验结果，需要将样品完全解冻，分析解冻后的样品中所含有的有机酸的种类及其含量。萨莱思葡萄酒在浓缩阶段，含有DL-酒石酸、D-苹果酸、L-苹果酸、一水柠檬酸、琥珀酸。其中酒石酸的含量最大也是最稳定的，而丙酮酸与琥珀酸只是在一个时间段检测出，且含量还比较低，一水柠檬酸在浓缩期含量变大，随后消失。D-苹果酸随着浓缩的时间越长，含量逐渐减小，而L-苹果酸却随着浓缩时间越长，含量逐渐增大，但是D-苹果酸与L-苹果酸浓度之和在逐渐增大。在陈酿期时，琥珀酸没有检测出来，丙酮酸出现，L-苹果酸，酒石酸含量降低、D-苹果酸的含量大致没有发生变化。在成品酒慕萨莱思中检测出了4种有机酸，分别是DL-酒石酸、L-苹果酸、丙酮酸、琥珀酸。

3 结论

利用液相色谱仪对浓缩阶段葡萄汁、慕萨莱思葡萄酒中有机酸进行了分析，在浓缩葡萄汁阶段，含有DL-酒石酸、DL-苹果酸、一水柠檬酸、琥珀酸。在慕萨莱思葡萄酒中只检测出了DL-酒石酸、L-苹果酸、丙酮酸、琥珀酸。定量实验采用HPLC法、GC-MS法分析慕萨莱思在发酵及陈酿的不同时期，所含有的有机酸的种类。在实验阶段优化条件，条件最终确定为：色谱柱型号CNW Athena C18，（120 A，4.6×250 mm，5 µm），0.01 mol·L-1NaH2PO4（pH=2.7）为流动相条件，0.8 mL·min-1的流速，柱温设定30 ℃，波长设定210 nm，进样体积10 μL，可以较好地分离和检测自酿慕萨莱思葡萄酒在不同时期有机酸含量的变化。所建方法的RSD为0.210%～0.598%，相关系数R2＞0.999。在GC-MS所分析出的有机酸的种类与HPLC中一部分酸有很大的差异，因为在HPLC中柱子的类型、仪器灵敏度、流动相pH值等都会对结果产生影响，最主要是因为样品成分过于复杂导致样品色谱峰无法很好地分离，所以有机酸种类的确定主要以GC-MS分析结果为判定依据，通过图谱库确认结果比较准确，HPLC仅仅通过出峰时间来进行定性是不够准确的尤其是成分比较复杂的情况下。通过对有机酸的变化进行检测，通过成分分析，可以对实际生产进行指导，未来可以对其变化机理进行进一步的分析。