牡荆素对异氟烷诱导大鼠神经细胞损伤的保护作用

陈琳琳　王艳生　齐英凯

(沧州市中心医院麻醉科，河北　沧州　061001)

术后认知功能障碍(POCD)是常出现在手术麻醉后患者中的中枢神经系统并发症，在老年患者中尤为常见，其表现为内心焦虑、精神错乱、记忆受损或短时间性格改变等〔1〕。POCD常导致患者的康复延迟、病死率增加，严重者甚至发展为阿尔茨海默病〔2〕。异氟烷(IF)是临床上常用的挥发性吸入麻醉药，其诱导和苏醒过程迅速、平稳，麻醉效力强，且对循环肝肾功能影响小〔3〕。而麻醉药物的细胞毒性和中枢神经系统抑制作用，被认为是导致POCD发生的主要原因〔4〕。研究显示POCD可能与中枢神经系统炎症反应有关，如促炎因子的过度释放是 IF诱导老年大鼠认知损伤的一个重要机制〔5〕。牡荆素(VT)又名牡荆苷，是从牡荆叶、牡荆子及山楂叶中提取的黄酮碳苷类有效单体成分，牡荆苷具有抗心肌梗死、抗炎镇痛、抗感染、降血压、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗记忆损伤和神经系统保护作用等多种药理作用〔6，7〕。本研究旨在探讨VT对IF诱导大鼠神经细胞损伤中的作用及机制。

1　材料及方法

1.1试剂及仪器IF(Baxter，USA)，VT(固体粉剂，纯度：99.8%，批号：2015034，西安昊轩生物科技)，MTT细胞生长增殖/毒性检测试剂盒(Sigma，USA)，兔抗人NSE单抗(CST，USA)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(博士德公司，武汉)，免疫组化检测试剂盒(福州迈新生物科技)，β淀粉样蛋白(Aβ)1～42,肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(INF)-γ的酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒(Sigma，USA)，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物，江苏)，奥林巴斯荧光倒置显微镜Olympus IX7(Olympus，日本，UIS2光学成像系统，Image-Pro Plus7.0成像系统)，Multiskan MK 3酶标仪(Thermo，USA，型号413MBY042078)，FACS Canto Ⅱ流式细胞仪(BD，美国)，Ste-phan ARTEC-C麻醉机(Drager，Ger)。

1.2海马神经细胞的分离及原代培养雄性新生SD大鼠1只(出生24 h内，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0011)。将SD大鼠脊椎脱臼法处死，断头后用75%的酒精消毒，剪开脑部的皮肤后分离出颅骨，使双侧大脑暴露后，分离出双侧的大脑半球，立即转移至含D-Hank液的培养皿中，小心分离皮层并取出海马组织，D-Hank液中漂洗3次后分离血丝和脑膜，得海马组织，将其用眼科剪剪成1.0 mm3小块，胰酶消化25 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，800 r/min离心10 min，弃培养基，用吸管缓慢吹打混匀，静置5 min，上清液即为海马神经细胞悬液，以4×105/ml的细胞密度接种到6 cm培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，接种24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48小时后加入10 μmol/L阿糖胞苷抑制非神经元细胞过度生长，随后每3 d半量换液一次。显微镜下观察海马神经细胞的形态，并采用免疫组化NSE染色鉴定。该实验的研究方案经我医伦理委员会批准，所有操作均符合动物伦理学。

1.3细胞及动物给药处理体外实验：按1.2的操作成功分离原代新生大鼠海马神经细胞，细胞培养于涂有多聚赖氨酸的35 mm培养皿中，调整细胞终浓度为106个/ml。实验分为空白对照组，2% IF组(IF)，2% IF+30 mg/L VT(IF+30 VT)组，2% IF+50 mg/L VT(IF+50 VT)组，2% IF+100 mg/L VT(IF+100 VT)组。2% IF由Ste-phan ARTEC-C麻醉机提供，载气为空气+5%CO2，空白对照组不经 IF处理，于恒温孵育箱内正常培养，其余各组均在不同浓度的VT处理前暴露于2% IF中6 h。

体内实验：20月龄、体重(500±50)g的雄性SD大鼠共15只，实验大鼠分五组，每组3只，包括对照组、IF、IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT组。对照组不吸入IF，于恒温动物房内正常培养，其余各组均在不同浓度的VT处理前置于麻醉诱导箱内统一吸入一次2%的 IF与O2(2 L/min)的混合气体，时间为2 h。随后在吸入 IF的第1～5天连续腹腔注射30、50、100 mg/kg的VT，每天1次。其中对照组注射等量生理盐水溶液，不同浓度VT组则使用生理盐水溶解。

1.4免疫组化NSE染色鉴定海马神经细胞取培养至第8 d的细胞，将细胞直接铺在12孔板上，用4%多聚甲醛固定后，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，4%的多聚甲醛固定30 min，过氧化氢消除过氧化氢酶5 min，室温下山羊血清封闭15 min，吸除多余液体后加NSE一抗(1∶1 000)孵育，4℃过夜，PBS清洗3次后室温孵育辣根酶标记的二抗10 min，PBS清洗3次，采用二氨基联苯胺(DAB)显色，经苏木素复染10 s后1%的HCl-C2H5OH分化，迅速用自来水冲洗，后经酒精脱水和二甲苯透明后，用中性树胶封片，显微镜下采集200倍的图像，NSE蛋白阳性表达的标准为神经元胞质及部分突起着色为棕黄色。

1.5MTT比色法检测细胞活性实验分组及处理方式见1.3，取培养至第8天经NSE免疫组化鉴定的海马神经细胞，以3×104个/ml的密度接种于96孔板中，每孔200 μl，培养箱内孵育24 h后，将IF、IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT组分别置于一侧带有进气口的透明聚乙烯塑料盒中，再置于37℃培养箱中，2% IF麻醉机提供，其中IF的载气为空气和5%CO2的混合气体，气体由密闭管道的进气口通入，使装有96孔板的盒子中的细胞暴露于2%IF中，而对照组则通入空气+5%CO2正常培养，处理6 h后弃培养上清，对照组和IF组加入DMEM培养基，IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT组分别加入30、50、100 mg/L的VT，培养箱内孵育4 h后，每孔加入15 μl的MTT(终浓度为5 g/L)，继续培养3 h后，弃上清培养液，加入200 μl的二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀10 min，酶标仪上540 nm波长下检测每孔的吸光度值，以与对照组吸光度值的百分比表示细胞活性。每个样设置5个复孔，实验重复3次。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡实验分组及处理方式见1.3，取培养至第8天经NSE免疫组化鉴定的海马神经细胞，以1×105个/ml的密度接种于6 cm培养皿中，每皿5 ml。采用MTT比色法体外对各组进行处理，48 h后PBS清洗细胞3次，加入0.25%胰酶，吹打至悬浮状态，每皿加入100 μl缓冲液、5 μl Annexin Ⅴ-FITC及5 μl 0.5 mg/L PI，避光4℃静置15 min，于流式细胞仪上检测各组海马神经细胞的凋亡情况。统计右下和右上象限的数值之和即为细胞凋亡的比例(早期凋亡与晚期凋亡之和)。每个样设置3个复孔，实验重复3次。

1.7ELISA检测Aβ1～42、TNF-α和INF-γ的含量实验分组及处理方式见1.2，将大鼠处死后立即取脑，冰上分离大鼠的双侧海马，放入冻存管置于液氮中，冻存48 h后称取各组组织100 mg，置于含2%烷基硫酸钠和50 mmol/L蛋白酶抑制剂的PBS中，4℃、12 000 r/min离心20 min后取上清液，严格参照ELISA检测试剂盒的说明书，分别进行Aβ1～42、TNF-α和INF-γ的含量检测，将稀释的样品加样并盖上封板膜，轻摇后在37℃反应60 min，洗板5次，分别加入显色液A和B，37℃下显色10 min后加入终止液，10 min内读取OD值，据此绘制浓度标准曲线，根据所测OD值找出标准曲线上对应的样本浓度，记录实验结果。每个样设置3个复孔，实验重复3次。

1.8统计学方法应用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料采用成组t检验，多组间数据比较经单因素方差分析和LSD-t检验。

2　结　果

2.1原代海马神经细胞的鉴定结果镜下观察显示海马神经细胞的生长状态良好，且所有细胞均胞体丰满。NSE的免疫组化检测结果显示细胞的胞质和部分突起为棕黄色着色，表明本培养方法可得到纯度较高的新生大鼠海马神经细胞。见图1。

2.2VT对 IF作用下海马神经细胞活性的影响与空白对照组(97.67±1.20)比较，IF组细胞活性(60.33±3.28)显著降低(t=10.681，P=0.000)。与IF组比较，IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT组(73.67±3.18、86.67±2.03)、70.33±1.20)显著增加(t=2.917，6.825，2.860；P=0.043，0.002，0.046)。

2.3VT对 IF作用下海马神经细胞凋亡能力的影响与空白对照组(9.41±0.30)%比较， IF组细胞凋亡率(42.54±0.75)%显著增加(t=40.962，P=0.000)。与IF组比较， IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT组〔(31.00±0.57)%、(12.34±0.87)%、(23.70±0.90)%〕显著降低(t=12.214，26.210，15.968；P=0.000，0.000 1，0.000)。

2.4VT对 IF作用下海马组织匀浆中Aβ1～42，TNF-α和INF-γ含量的影响与空白对照组Aβ1～42、TNF-α和INF-γ含量(756.91±12.24，0.85±0.02，72.54±1.29)比较，IF组(1 276.00±14.37，2.15±0.08，97.91±1.50)均显著上升(t=27.512，15.596，12.812；均P=0.000)。与IF组相比， IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT组Aβ1～42含量(916.81±44.17，tIF+30 VT=7.736，PIF+30 VT=0.002；703.71±12.24，tIF+50 VT=30.316，PIF+50 VT=0.000 1；1 053.00±28.91，tIF+100 VT=6.918，PIF+100 VT=0.002)、TNF-α(1.82±0.04，tIF+30 VT=3.654，PIF+30 VT=0.022； 1.52±0.02，tIF+50 VT=7.634，PIF+50 VT=0.002；1.57±0.03，tIF+100 VT=6.586，PIF+100 VT=0.003)和INF-γ(81.67±1.67，tIF+30 VT=7.234，PIF+30 VT=0.002；71.77±0.91，tIF+50 VT=14.907，PIF+50 VT=0.000；75.68±1.86，tIF+100 VT=9.306，PIF+100 VT=0.001)的含量均显著降低。

3　讨　论

研究显示，吸入3% IF的大鼠其神经细胞受到明显损伤，且学习记忆能力也受到了显著影响，其机制可能与IF可引起炎症反应、氧化应激或细胞凋亡等有关〔8〕。VT为黄酮碳苷类化合物，具有抗感染、抗氧化、抗凋亡等药理作用，有一定的神经保护和抗记忆损伤作用〔9〕。

研究显示老年大鼠在高浓度吸入麻醉药物后，可使其神经细胞发生凋亡、导致其认知功能障碍，而许多中药可有效地改善该过程，如姜黄素可改善高浓度吸入麻醉药物所致的老年大鼠学习记忆力损害〔10〕、红景天苷可改善吸入麻醉药所致的阿尔茨海默病大鼠的认知功能障碍〔11〕、竹叶黄酮可刺激神经细胞的突触生长，对神经细胞产生保护作用〔12〕。本研究发现VT也能显著抑制 IF所致的海马神经细胞的凋亡，增加细胞的活性，提示 VT可能有潜力用于POCD的防治。

研究认为Aβ的生成、聚集和沉积是认知功能损害相关疾病如POCD等的重要病理学基础〔13〕。Aβ1～42对神经细胞有较强的细胞毒性，能使Aβ纤维聚集而产生老年斑，对人的认知功能产生严重影响〔14〕。已有研究显示，2% IF处理人胶质瘤细胞可显著促进Aβ的生成〔15〕。本研究表明2% IF处理大鼠，使大鼠海马组织匀浆中Aβ1～42含量显著增加，而不同浓度的VT均可显著抑制Aβ1～42含量，说明VT可显著改善 IF所致大鼠神经细胞损伤，该过程可能与抑制Aβ1～42的生成有关。

研究报道还认为POCD和中枢神经系统炎症反应间存在相关性，如过度释放的促炎因子可能使IF诱导大鼠发生POCD〔16〕。炎症反应中发挥重要作用的TNF-α和IFN-γ能降低胰岛素降解酶的表达水平，使小胶质细胞的Aβ1～42降解能力显著降低〔17〕。本研究结果表明VT可通过增强大鼠抗感染能力、降低TNF-α和IFN-γ的含量而抑制IF所致的神经细胞损伤。

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