高效液相色谱梯度洗脱法同时测定调气丸中6个主要成分含量

张铭,马丽颖

调气丸处方源于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第二册，由厚朴(姜制)、山楂(炒制)、山楂(炭制)、苍术(米泔水炒)、木香、香附(醋炒)等14味中药材加工而成的褐色水丸，具有调气止痛、健胃消食的功效，临床上主要用于胃脘胀闷、胃口疼痛、呃逆、嗳腐吞酸、腹满带下、便泻痢疾等病症的治疗。调气丸质量控制指标相对较少，现行标准仅规定了性状及丸剂通则项下的检测项目[1-2]，也未检索到对该制剂多组分含量测定的文献报道。为进一步提高现行标准，有效控制调气丸产品质量，本文对方中主要药味厚朴[3]中的和厚朴酚、厚朴酚以及山楂[3](炒制)和山楂[3](炭制)中的牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷采用高效液相梯度洗脱色谱法[4]进行了同时测定，为提高调气丸质量标准提供数据支持。

1 材料

1.1实验仪器Agilent 1200系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AX205型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒—托利多公司)；SB-5200DTD型超声波发生器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2试药调气丸(每20粒重1.0 g)来源于山东宏济堂制药集团股份有限公司(批号1602005、1604009、1605013)；和厚朴酚对照品(批号110730-201614，含量99.3%)、厚朴酚对照品(批号110729-201513，含量98.8%)、牡荆素葡萄糖苷对照品(批号111979-201501，含量92.8%)、牡荆素鼠李糖苷对照品(批号111668-200602，含量100.0%)、牡荆素对照品(批号111687-201603，含量95.7%)和金丝桃苷对照品(批号111521-201507，含量94.3%)均来源于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂为分析纯。

注：1为和厚朴酚；2为厚朴酚；3为牡荆素葡萄糖苷；4为牡荆素鼠李糖苷；5为牡荆素；6为金丝桃苷图1 高效液相色谱图：A为混合对照品；B为样品；C为厚朴阴性供试品；D为山楂(炒制)和山楂(炭制)阴性样品

2 实验方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Venusil MP C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-1.0%冰醋酸溶液，梯度洗脱(0～11 min，16.0%A；11～20 min，16.0%A→28.0%A；20～39 min，28.0%A→45.0%A；39～45 min，45.0%A→16.0%A)；0～20 min在294 nm[5-8]波长下检测和厚朴酚及厚朴酚；20～45 min在340 nm[9-11]波长下检测牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷；流速：0.9 mL/min；柱温：30 ℃。

2.2溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷各适量，分别用甲醇制成对照品储备液(和厚朴酚0.594 g/L、厚朴酚0.852 g/L、牡荆素葡萄糖苷0.718 g/L、牡荆素鼠李糖苷4.136 g/L、牡荆素0.532 g/L、金丝桃苷0.368 g/L)。再依次吸取各对照品储备液：5.0、5.0、5.0、5.0、2.5、2.5 mL，用甲醇制成各成分浓度分别为0.029 7、0.042 6、0.035 9、0.206 8、0.013 3、0.009 2 g/L的混合对照品溶液。

2.2.2 样品溶液的制备 取研细后的调气丸约2.0 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定重量，采用超声波(功率200 W，频率40 kHz)超声提取30 min，放冷，用甲醇补足所减失的重量，摇匀，过滤，即得调气丸样品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按调气丸的制备工艺，分别制备不含厚朴(姜制)的阴性样品、不含山楂(炒制)和山楂(炭制)的阴性样品，再按“2.2.2”项下的方法制成对应的2个阴性样品溶液。

2.3专属性试验精密吸取“2.2.1～2.2.3”项下的溶液各适量，依法进样测定，结果显示混合对照品溶液、样品溶液在相应的和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的保留时间处均有吸收峰，厚朴阴性样品溶液色谱图中无和厚朴酚、厚朴酚的吸收峰，山楂(炒制)和山楂(炭制)阴性样品溶液色谱图中无牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的吸收峰，说明各成分的检测不受干扰，色谱图见图1。

2.4标准曲线的制备分别精密量取“2.2.1”项下对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6个20 mL量瓶中，用甲醇制成6个不同浓度的混合对照品溶液(样品1：和厚朴酚2.97 mg/L、厚朴酚4.26 mg/L、牡荆素葡萄糖苷3.59 mg/L、牡荆素鼠李糖苷20.68 mg/L、牡荆素2.66 mg/L、金丝桃苷1.84 mg/L；样品2：和厚朴酚5.94 mg/L、厚朴酚8.52 mg/L、牡荆素葡萄糖苷7.18 mg/L、牡荆素鼠李糖苷41.36 mg/L、牡荆素5.32 mg/L、金丝桃苷3.68 mg/L；样品3：和厚朴酚14.85 mg/L、厚朴酚21.30 mg/L、牡荆素葡萄糖苷17.95 mg/L、牡荆素鼠李糖苷103.40 mg/L、牡荆素13.30 mg/L、金丝桃苷9.20 mg/L；样品4：和厚朴酚29.70 mg/L、厚朴酚42.60 mg/L、牡荆素葡萄糖苷35.90 mg/L、牡荆素鼠李糖苷206.8 mg/L、牡荆素26.60 mg/L、金丝桃苷18.40 mg/L；样品5：和厚朴酚44.55 mg/L、厚朴酚63.90 mg/L、牡荆素葡萄糖苷53.85 mg/L、牡荆素鼠李糖苷310.20 mg/L、牡荆素39.90 mg/L、金丝桃苷27.60 mg/L；样品6：和厚朴酚59.40 mg/L、厚朴酚85.20 mg/L、牡荆素葡萄糖苷71.80 mg/L、牡荆素鼠李糖苷413.60 mg/L、牡荆素53.20 mg/L、金丝桃苷36.80 mg/L)，依法进样测定和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的峰面积，以质量浓度(x，mg/L)作为横坐标，峰面积y为纵坐标，得和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的回归方程，结果见表1。

表1 线性关系试验结果

2.5加样回收率试验取批号为1602005的调气丸6份，研细，每份约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的牡荆素鼠李糖苷对照品6.34 mg，精密加入和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素和金丝桃苷混合对照品溶液(和厚朴酚0.714 mg/L、厚朴酚1.302 mg/L、牡荆素葡萄糖苷0.859 mg/L、牡荆素0.313 mg/L、金丝桃苷0.199 mg/L)1.0 mL，再精密加入甲醇50 mL，按“2.2.2”的方法制备加样回收样品溶液，依法进样测定，计算和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的回收率及相应的RSD，结果见表2。

表2 加样回收率实验结果

2.6重复性试验取同一批次调气丸样品(批号1602005)，按“2.2.2”项下制备方法制备调气丸供试品溶液6份，依法进样测定，分别计算和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的含量，结果所测6个组分含量的RSD依次为1.22%、0.75%、1.06%、0.37%、1.21%和0.94%。

2.7精密度试验取“ 2.2.1”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，依法测定和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的峰面积，结果所测各成分峰面积的RSD分别为1.06%、0.95%、1.27%、0.73%、1.41%和1.12%。

2.8稳定性试验取同一份供试品溶液，在室温下分别于0、2、4、6、8、10、12 h后，依法进样测定和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的峰面积值，结果调气丸在室温下12 h内稳定，所测6个成分峰面积的RSD分别为1.05%、0.94%、1.01%、0.86%、1.19%和1.21%。

2.9调气丸样品含量测定取3个不同批号的调气丸，按“2.2.2”项下制备方法制备调气丸供试品溶液，依法进样测定和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷的峰面积，所测各成分含量结果见表3。

表3 调气丸样品含量测定结果/(mg/g)

3 讨论

3.1色谱条件的考察作者在实验中分别考察了甲醇—水[12-13]、乙腈—水、乙腈—1.0%冰醋酸溶液[14]和乙腈—0.5%磷酸溶液等流动相体系，以色谱峰基线平稳情况和所测各成分分离情况为指标，优选最佳的流动相体系，对比结果显示乙腈—1.0%冰醋酸溶液优于其他流动相体系，但所测成分和厚朴酚、牡荆素鼠李糖苷的分离效果不太理想。在此基础上对流动相的比例进行摸索，最终选优最佳的流动相体系为：乙腈—1.0%冰醋酸溶液梯度洗脱(0～11 min，16.0%A；11～20 min，16.0%A→28.0%A；20～39 min，28.0%A→45.0%A；39～45 min，45.0%A→16.0%A)。

3.2供试品提取方法的确定笔者在调气丸供试品溶液的制备实验中，分别考察不同的提取方式(回流、超声、索氏)对所测6个成分和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷提取效果的影响，结果三种提取方式提取效果差异不大，超声提取较为简便，故调气丸供试品溶液提取方式选为超声提取；在此基础上又对超声提取的功率和频率(150 W 28 kHz、200 W 40 kHz、300 W 40 kHz)、提取溶剂(70%甲醇、纯甲醇、纯乙醇)、提取时间(15、30、45 min)、溶剂量(25、50、100 mL)进行了考察，最终选优最佳的调气丸供试品溶液的制备方法为：加入50 mL甲醇超声(功率200 W，频率40 kHz)提取30 min。

3.3检测波长的选择取所测各成分和厚朴酚、厚朴酚、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷对照品储备溶液适量，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果和厚朴酚、厚朴酚在294 nm处有最大吸收，牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷在340 nm处有最大吸收。同时参考《中国药典》2015年版一部厚朴、山楂叶提取物项下各成分的检测波长，结合所测各成分的色谱图，最终确定采用波长切换法0～20 min时在294 nm波长下检测和厚朴酚及厚朴酚，20～45 min在340 nm波长下检测牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷。

综上所述，本研究采用高效液相波长切换联合梯度洗脱法测定调气丸中6个成分的含量，方法简单快速而且准确度高，填补了本品液相色谱分析方面的研究空白，可在一定程度上保证调气丸功效及质量。