HPLC法测定低温烘焙绿豆中牡荆苷与异牡荆苷的含量及变化

王雪，肖萍，2，王步江，2，王娜，2，黄宗海，2，刘金福，2，*

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；2.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384）

绿豆又名青小豆，我国绿豆资源丰富，在黄河、淮河流域、长江下游及东北、华北地区等地均有种植[1]。一般每100 g 绿豆含蛋白质约25 g、碳水化合物55 g～62 g、脂肪0.5 g～1.2 g，而且含有人体所需的多种维生素和矿质元素，是营养丰富的食品原料[2]。绿豆作为常用的药食两用植物，具有清热祛暑、利水消肿、解毒排脓、抗菌抑菌、降血脂、降血糖、抗肿瘤、预防癌症等功能[3-5]。加之绿豆适口性好，易消化，因而对绿豆食品的开发应用很多，比如绿豆凉粉、绿豆粉丝、绿豆糕、绿豆煎饼、绿豆沙等。近些年，也有采用去皮、磨浆、过滤、喷雾干燥等工艺生产绿豆全粉，但绿豆皮中的膳食纤维、黄酮类等活性物质没有得到充分利用，造成了绿豆资源浪费；同时高温干燥使绿豆中的活性成分失活，降低了绿豆的营养价值[6]。因此开发全绿豆营养食品对绿豆产品的开发具有一定的现实意义。

研究发现，牡荆苷与异牡荆苷是自然界中常见的黄酮类物质，已证实二者具有多种生物活性，如抗氧化作用及抗炎、抗病毒作用[7-9]。闫冲等对绿豆、黑豆、赤豆中的牡荆苷与异牡荆苷进行检测，发现只有绿豆中含有牡荆苷与异牡荆苷[8]。李艳荣等建议为了对绿豆药材进行有效的质量控制，除测定常规成分外，还可以以牡荆苷和异牡荆苷的含量作为重要的特性指标进行检测[2]。

因此，本文拟将以牡荆苷和异牡荆苷为分析指标，通过对低温烘焙绿豆加工前后牡荆苷和异牡荆苷含量的变化来了解低温烘焙技术对绿豆中活性成分的影响，旨在为全绿豆营养食品的开发生产提供检测方法和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

绿豆：产地为天津市静海区；甲醇（色谱纯）：凯马特（天津）化工科技有限公司；冰醋酸（色谱级）：天津市科密欧化学试剂有限公司；牡荆苷、异牡荆苷标准品（纯度大于99%）：上海斯信生物科技有限公司。

1.2 试验仪器

远红外烤箱（UKOEO 猛玛象）：珠海家宝德电器有限公司；电子天平（JA2003 型）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；超声波清洗仪（KB3200B 型）：昆山市超声仪器有限公司；水浴锅（HWS-28 型）：上海恒科学仪器有限公司；高效液相色谱仪（1260 型）：美国安捷伦科技有限公司。分析过程所有用到的水均为Mili-Q 超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 低温烘焙绿豆的加工方法及感官评定

工艺流程：绿豆→挑选→清洗→沥干→低温烘焙

通过感官评价和烘焙的温度、时间等单因素试验确定最佳工艺条件。低温烘焙绿豆感官评定标准见表1。

1.3.2 高效液相色谱测定方法

1.3.2.1 样品处理条件的优化

将生绿豆干燥除去水分、烘焙绿豆用超微粉碎机进行粉碎，过80 目筛，备用。准确称取5.000 g 绿豆粉末，分别置于100 mL 的烧杯中，加入30 mL 分析纯甲醇，分别超声处理30、60、120 min，减压抽滤后弃掉滤渣，滤液过 0.22 μm 滤膜，定容于 50 mL 容量瓶，作为待测样品。

表1 低温烘焙绿豆感官评定标准Table 1 Sensory evaluation criteria for low temperature baked mung beans

1.3.2.2 色谱条件

采用 Venusil ABS C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色谱柱；流动相：A，超纯水；B，甲醇-0.1 %冰醋酸溶液（体积比 80∶20）；梯度洗脱（0 min～3 min，85%～70%B；3 min～6 min，70%～55%B；6 min～9 min，55%～35%B；9 min～12 min，35 %～35 % B；12 min～15 min，35 %～70 % B；15 min～18 min，70 %～85 % B），检测波长：340 nm；柱温：30 ℃；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL。

1.3.2.3 标准品的配制

准确称取20 mg 牡荆苷和异牡荆苷标准品，加入甲醇定容至10 mL，配制成2 mg/mL 牡荆苷和异牡荆苷标准品溶液；并利用甲醇制备成不同浓度的牡荆苷与异牡荆苷混合溶液。

1.3.2.4 样品处理

准确称取原料绿豆和烘焙绿豆粉末，按照1.3.2.1方法在最优提取时间条件下，定容于色谱纯甲醇中，作为待测样品。

2 结果与分析

2.1 低温烘焙绿豆加工条件及感官评价

本试验在155 ℃左右通过热风干燥的方式对绿豆进行烘焙熟化发现，熟化的绿豆质地坚硬、疏松感差，带有明显的豆腥味。低温烘焙谷物类食品是指采用远红外加热一般温度不超过130 ℃条件下烘焙一定的时间，使物料熟化，并呈现特有的香气和风味。试验首先分别对烘焙温度为 110、120、130、140、150 ℃、时间分别为 120、150、180、210、240 min，进行单因素试验，通过色泽、香气、风味口感等感官评价，对适宜的烘焙温度和时间的进行考察，发现在130 ℃左右烘焙一定的时间可以得到具有熟化绿豆良好风味和口感的产品，见表2。

表2 不同低温烘焙温度、时间的绿豆感官评价结果Table 2 Sensory evaluation results of mung beans at different temperature and time of baking

从感官评价的综合得分来看，采用远红外烘焙熟化绿豆适宜的条件为温度130 ℃，时间180 min，得到的产品口感酥脆，粉碎研磨后绿豆的香气浓厚，具有更好的冲调性。

2.2 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定牡荆苷与异牡荆苷的方法学考察

2.2.1 超声波处理时间对牡荆苷与异牡荆苷含量测定的影响

样品前处理采用超声辅助提取，HPLC 法分别测定了提取30、60、120 min 时原料绿豆和低温烘焙绿豆中牡荆苷和异牡荆苷的含量，结果如图1和图2所示。从图中可以看出，无论是原料绿豆还是低温烘焙后的绿豆，牡荆苷和异牡荆苷出峰时间相同，且杂峰少，杂峰峰面积很小，牡荆苷和异牡荆苷出峰时间分别在14.4 min 和14.7 min。比较超声波3个处理时间的牡荆苷和异牡荆苷的峰面积发现处理60 min 后基本稳定，以此做为样品的前处理条件。

2.2.2 精密度考察

精密吸取混合标准品10 μL，连续进样6 次，测定峰面积，计算牡荆苷与异牡荆苷RSD 分别为0.79%与0.84%，表明该方法的精密度良好。

2.2.3 线性关系考察

取一定浓度的牡荆苷与异牡荆苷标准品溶液，用甲醇依次稀释制成系列浓度的溶液，按1.3.2.2 色谱条件进行测定，见图3、图4。以峰面积（Y，mAu）为纵坐标对样品浓度（X，mg/mL））绘制标准曲线，得回归方程及线性范围分别为：牡荆苷：Y=307 742X+21.01，R2=0.999 3；异牡荆苷：Y=52 747.5X-9.24，R2=0.999 9。

2.2.4 稳定性试验

取同一批样品溶液，分别于配制0、24、48 h 后测定生绿豆和低温烘焙绿豆中牡荆苷与异牡荆苷的含量。生绿豆中牡荆苷和异牡荆苷RSD 分别为0.7%和0.65%，低温烘焙绿豆中RSD 分别为0.51%和0.56%，说明供试品溶液中牡荆苷与异牡荆苷至少在48 h 内稳定。

图1 原料绿豆中牡荆苷和异牡荆苷含量测定HPLC色谱图Fig.1 Determination of aparin and heterophyllin in the raw mung beans by HPLC chromatography

图2 低温烘焙绿豆中牡荆苷和异牡荆苷含量测定HPLC色谱图Fig.2 Determination of aparin and Heterophyllin in low-temperature baked mung beans by HPLC chromatography

图3 牡荆苷标准曲线Fig.3 Standard curve of aminoside

图4 异牡荆苷标准曲线Fig.4 Standard curve of isomeronin

2.2.5 重复性试验

取同一批样品溶液，按1.3.2.4 方法制备样品溶液5 份，分别测定生绿豆和低温烘焙绿豆中牡荆苷与异牡荆苷的含量，结果生绿豆的RSD 分别为1.32%和1.62%，低温烘焙绿豆的RSD 分别为1.46%和1.52%。结果小于3%，表明方法重复性良好。

2.2.6 回收率试验

取已知含量的生绿豆粉末和低温烘焙绿豆粉末6 份，各约5 g 精密称定，分别精密加入牡荆苷对照品0.02 mg 及异牡荆苷对照品溶液0.2 mg 适量，按1.3.2.4项下方法制备样品溶液，按照上述条件进行含量测定，计算加样回收率，结果绿豆中牡荆苷与异牡荆苷的平均加样回收率为101.5%和98.37%，低温烘焙绿豆中牡荆苷和异牡荆苷的平均加样回收率为96.3%和92.8%，表明其回收率良好。

2.3 绿豆及低温烘焙绿豆中牡荆苷与异牡荆苷含量及变化

样品通过超声辅助提取60，分别测得原料绿豆中牡荆苷和异牡荆苷的含量为（0.044±0.002）%和（0.033±0.000 5）%，低温烘焙绿豆中牡荆苷和异牡荆苷含量分别为（0.047±0.002）%和（0.036±0.001）%，即低温烘焙加工后绿豆中牡荆苷和异牡荆苷的含量与原料绿豆比较未发生明显的变化，低温烘焙加工后含量略高的原因可能是通过烘焙加工后原料质地变得疏松，细胞易碎，提高了有效成分的溶出率。

图5 原料绿豆和低温烘焙绿豆中牡荆苷和异牡荆苷的含量变化Fig.5 Changes of content of aparin and isoamurenin in mung beans and low-temperature baked mung beans

由图5绿豆中主要的药效成分牡荆苷和异牡荆苷的含量变化来看，采用低温烘焙工艺加工的绿豆有效的避免了一部分活性成分的损失，且低温烘焙工艺干燥熟化的绿豆质地疏松，易于粉碎，冲调性好，去除了豆腥味，具有浓郁的特有香气，作为原料或配料更有利于相关产品的开发生产。

4 结论

为开发全绿豆营养食品，本文采用低温烘焙工艺，在130 ℃，加热180 min 条件下加工熟化绿豆，并利用美国Agilent1260 系统建立测定了加工前后绿豆中牡荆苷与异牡荆苷含量的变化。结果表明：原料绿豆和经低温烘焙加工熟化后的绿豆中牡荆苷与异牡荆苷的含量分别为（0.044±0.002）%、（0.033±0.000 5）%和（0.047±0.002）%、（0.036±0.001）%，可见低温烘焙工艺加工的绿豆中牡荆苷和异牡荆苷含量未发生明显变化。说明该工艺加工的绿豆不仅保留了绿豆的香气，具有较好的冲调性，而且避免了绿豆中生物活性物质的损失，其作为原料或配料生产的食品可保留较高的营养价值。