辅助生殖技术对试管婴儿活产率影响的研究进展

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(1.空军工程大学校务部门诊部，陕西 西安 710038；2.空军军医大学第二附属医院妇产科生殖医学中心，陕西 西安 710038)

自1978年世界上第一位试管婴儿诞生以来，关于辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)其中一个重要问题是其相对较低的每周期活产率。根据2009年在欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)登记的50多万名试管婴儿的信息，通过自身新鲜胚胎移植的女性，包括体外受精(in vitro fertilization，IVF)和卵胞浆内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，其周期的活产率是22%，冷冻周期移植的活产率是15%，而通过赠卵移植的女性，新鲜周期和冷冻周期移植的活产率达到了30%[1]。这些指标明显低于2009年由美国疾病控制中心(CDC)公布的相关数据。美国CDC公布的数据显示，自身新鲜卵子或胚胎移植的活产率是37%，冷冻周期是30%，而通过赠卵进行新鲜周期和冷冻周期移植的活产率分别是55%和34%。ESHRE与美国CDC两者公布数据差异的一部分原因可能是由于美国的ART临床机构公布ART结局时存在偏差[2]。但需要强调的是，这些数据主要是用作参考和了解大规模经ART助孕人群的治疗情况，而并非用来进行系统分析和统计。

尽管近些年来ART周期移植的活产率有小幅度增高，但ART的成功率仍没有达到令人满意的程度。近十几年许多研究者和研究机构投入了大量人力、物力、财力用于研究超数排卵药物治疗，配子获取和成熟技术，助孕技术，配子、胚胎的体外培养和冷冻保存，胚胎的优选，胚胎移植的质量控制，黄体期支持治疗；卵巢过度刺激综合征的预防及子宫内膜的移植条件等其他因素[3]。从这些巨大的投入来看，ART技术本身就可能会影响周期活产率。

目前有许多文献报道了ART对印记紊乱、印记基因甲基化水平及ART子代健康的潜在影响[4-6]，但是关于ART引起的表观遗传修饰改变对活产率的影响却鲜有报道。ART治疗过程中的各项体外操作和体外培养是在胚胎发生全基因表观遗传重编程这一特殊发育时期进行的[7]。因此这些人为操作可能会导致胚胎的表观遗传修饰紊乱，进而影响移植前胚胎的发育和ART周期活产率。现就ART治疗过程中的各项体外操作和体外培养对周期活产率影响的相关研究进展进行综述。

1卵巢刺激

目前认为，卵细胞在生长阶段将会进行表观遗传标记，这一过程发生在卵细胞减数分裂完成和排卵之前[8]，这提示超数排卵过程可能改变卵细胞的表观遗传修饰，进而影响后续的ART活产率。超数排卵可能使卵细胞发育速度过快，卵细胞不够成熟或者发生选择性闭锁，这种负面效果会影响卵细胞的质量，并且可能会干扰卵细胞在发育过程中的甲基化印记和移植前胚胎甲基化印记的维持。在对小鼠的研究中发现，超数排卵对母源印记表达基因(H19)和父源印记表达基因(Snrpn，Peg3，Kcnq1ot1)的甲基化水平的影响存在剂量效应关系[9]。此外，外源性激素药物的应用可能改变子宫环境，影响子宫内膜的成熟[10]和参与正常子宫内膜容受性基因的转录活性[11]，因此会干扰基因印记的维持。

最近一篇文献综述认为，与女性卵细胞基因获取印记相比，卵巢刺激对基因印记维持的不良效应更加显著[12]。但是，这项研究存在一定的缺陷，这些卵细胞均来自IVF或ICSI周期中质量较差的卵细胞，这些卵细胞对人绒毛膜促性腺激素(hCG)的促进卵子成熟作用反应不佳，因此该文献的结论可信度不高。

2配子低温贮存

卵子和精子的低温贮存均可能会影响受精之前的配子和移植前胚胎的基因印记。上述提到，卵细胞减数分裂完成和排卵之前，卵细胞在生长阶段将会发生表观遗传标记。同样地，窦状小卵泡的全基因组转录活性沉默是发生在减数分裂完成之前[12-13]。同时，成熟的卵泡储存了大量的mRNA，这些mRNA携带了许多在减数分裂期、受精时和移植前发育阶段所需蛋白的编码信息，包括卵细胞特异性DNA甲基化转移酶(DNMT1o)，这种酶在早期发育阶段起着维持基因甲基化标记的作用[14]。因此，卵细胞中储存的信息对卵子成熟、受精和移植前胚胎发育阶段，具有表观调控的作用。

2.1卵子冷冻

与慢速冷冻卵子相比，卵子玻璃化冷冻解冻后更容易存活，具有较高的胚胎发育潜能。另外，经过玻璃化冷冻的卵子，其受精率、移植率、妊娠率和活产率均接近于新鲜的卵子(针对的主要是年龄不超过34岁的女性)[15-16]。但另有一篇设计良好的配对随机对照试验研究认为，玻璃化冷冻卵子行ICSI时的受精率较差，并且受精成功的胚胎发育至囊胚速度较慢，但是关于非整倍性囊胚的发生率和继续妊娠率，玻璃化冷冻卵子组与非玻璃化对照组之间相近[17]。

关于玻璃化冷冻尚未成熟的人卵细胞的一些研究表明，与卵子体外成熟相比，玻璃化冷冻并没有导致印记甲基化紊乱的风险增加[18]。同时研究发现，可编码8个与胚胎发育密切相关的蛋白质转录本，它们在玻璃化冷冻后解冻的卵子与在人减数分裂中期(MⅡ)的新鲜卵子中含量相近[19]。但也有研究认为，人MⅡ期卵子经玻璃化冷冻和慢速冷冻后解冻均减少卵细胞中储存的转录本水平[20]。

2.2精子冷冻

相反，精子印记标记是一个逐步重建的过程，从胎儿发育时期的原始生殖细胞开始，到出生后精子减数分裂仍继续进行着[21]。男性精子的甲基化印记在A型精原细胞就已经建立，并通过精子生成过程中DNMTs的mRNA表达和蛋白合成来维持其甲基化印记。精细胞基因组某些区域由组蛋白而非鱼精蛋白包被，使得精子基因组结构不至过于紧密，这有利于受精前基因进行转录。另外，精子的核组蛋白成分可以丰富有活性的逆转座子，这种逆转座子维持精子基因组某些区域的转录活化状态。精原细胞也具有翻译活性，可以利用线粒体酶翻译来自细胞核和线粒体的转录本[17]。

目前尚缺乏比较新鲜精子、慢速冷冻精子及玻璃化冷冻精子之间的ART活产率的临床随机对照试验。但是已了解到，慢速冷冻人类精子可以造成精子DNA碎片化，但精子慢速冷冻没有影响精子一些母源和父源印记基因、重复序列，及与精子生成和男性不孕相关的特异性基因的甲基化模式[22]。相反，玻璃化冷冻精子和低温贮存精子可造成精子DNA损伤及一些男性特异性基因和印记基因mRNAs的表达[23]。

3卵子体外成熟

正常排卵的女性[24]和多囊卵巢的女性[25]，当其卵子经过体外非刺激性成熟培养后，与IVF或ICSI周期的标准超数排卵相比，均会表现出较低的胚胎移植率和临床妊娠率。多囊卵巢的女性卵子经过体外成熟培养后，也会表现出较低的活产率[25]。卵子体外成熟引起的不良影响，可能与体外成熟培养期间基因印记标记紊乱、基因转录异常和蛋白合成异常有一定的联系。研究发现，与体内成熟的卵子相比，体外成熟培养的MⅡ期卵子储存的基因转录本发生了改变，而这些转录本与减数分裂、细胞周期调控及细胞蛋白代谢过程具有相关性[26]。此外，一项关于恒河猴的研究认为，未经hCG处理的体外成熟培养的卵子与经过hCG处理的体内成熟卵子相比，两组卵细胞中的转录本水平仅有微小的差异性[27]。

4卵泡浆内单精子注射技术

尽管在一些男性和不明原因的不孕夫妇中，ICSI相对于IVF，可以增加受孕率并降低受精失败的风险[28]。但是2010年美国CDC公布的关于ART总结报道中，认为从2001至2010年期间，与无ICSI的ART周期相比，ICSI周期的移植活产率一直表现为较低，在新鲜赠卵周期中，ICSI周期活产率是45%～55%，无ICSI的ART周期活产率是49%～57%，而在新鲜自身卵细胞移植周期中，ICSI周期活产率是32%～36%，无ICSI的ART周期活产率是35%～38%[2]。无ICSI的ART周期和ICSI周期这两组活产率的微小差别，可能的原因是用于ICSI的精子是源自精液异常的男性患者，这些精子基因或表观遗传修饰存在异常。这种异常的精子作用于MII期卵子后可能会导致形成的胚胎表观遗传修饰缺陷，从而降低了ICSI周期的活产率。但是关于ICSI本身是否会引起胚胎表观遗传发生改变，有关这方面的研究结果尚存在较大的争议。

有文献报道，ICSI来源的胚胎和IVF来源的胚胎，两者在形态评分较低的情况下，前者更容易表现出组蛋白3-赖氨酸-9(H3K9)低甲基化水平[29]。也有研究认为，ICSI来源的和IVF来源的人类胚胎在全基因组的甲基化水平、染色质结构和印记基因的甲基化，两者无显著性差异[30]。关于小鼠的研究也认为，ICSI来源的和IVF来源的囊胚，两者全基因组表达情况明显不同[31]。另一研究发现，ICSI来源的和IVF来源的小鼠胚胎，两者在囊胚阶段出现的转录组差异在新生儿期仍存在，到了8周后这种差异才消失，然而，还没有证据显示这种差异会通过自然交配遗传给下一代[32]。

5胚胎体外培养系统

一篇随机对照试验的系统综述仍没有确定出哪种胚胎培养基可以保证得到最好的ART临床结局[33]。而且在被纳入分析的研究中发现，在不同的培养基质之间，其相应的临床妊娠率存在超过5%的差异，这也说明了选择良好的培养基对于IVF或ICSI周期成功率是有必要的。在移植前阶段，人类囊胚处于不适宜的培养环境中，其全基因组表达模式会受到干扰[34]。但是在对小鼠的实验中，研究者发现小鼠胚胎尽管经过不适宜的培养基培养，但是其产生的子代仍是健康的，因此认为胚胎培养基可能不会对所有胚胎的全基因组表达产生干扰[35]。

6胚胎低温贮存

相关文献报道，与新鲜胚胎移植相比，冻融胚胎移植的临床妊娠率和继续妊娠率均较高，并可以降低与多胎妊娠无关的胎儿期和围产期发病率，其原因可能是冻融胚胎周期的胚胎与子宫内膜的同步性较好[36-37]。但是，胚胎低温贮存对ART活产率也有负面影响。2011年美国CDC公布的数据显示，冻融胚胎的周期活产率是35.7%(2 500/7 143)，新鲜胚胎的周期活产率是54.8%(5 352/9 767)[2]。但是美国CDC的数据没有详细说明胚胎低温贮存的方式及胚胎是何时冷冻和移植的，而这一点很重要，原因是相对于卵裂期胚胎和慢速冷冻的胚胎，囊胚和玻璃化冷冻胚胎的妊娠率更高。相关数据表明，胚胎低温贮存可以改变DNA甲基化和基因表达，尤其是受精卵的慢速冷冻，明显可以改变移植前与发育相关基因的表达[38]。

7胚胎活检

来自1997至2008年的欧洲数据显示，胚胎移植前基因诊断(PGD)和移植前基因筛选(PGS)周期的移植率、临床妊娠率、流产率及活产率与单纯ICSI周期相接近[39-40]。近年的一些前瞻性研究报道，与仅通过形态学评分选择的囊胚相比，经过活检的整倍性囊胚选择性移植后，能够提高临床移植率、持续移植率、临床妊娠率和活产率[41-43]。但是胚胎活检这一过程是否安全，目前还没有定论，原因是这些经过PGD或PGS的胚胎本身就存在本质上的缺陷。

目前也有针对胚胎活检技术本身是否对人类胚胎和胎儿发育产生影响的相关研究，结果认为，胚胎活检操作和一些物理化学干涉，不论多轻微，均有可能影响子代短期或长时程健康。例如，在人类D2和D3的胚胎中，对第一和第二极体进行激光活检与未行活检的胚胎相比，前者胚胎更容易出现发育迟滞和形态学缺陷[44]。与未行活检胚胎或仅移除1个分裂球细胞相比，从8细胞阶段移除2个分裂球细胞会降低囊胚形成率、生化妊娠率及活产率[45]。另外，当胚胎发育至6～8个细胞阶段时，移除其1个分裂球细胞，对该胚胎进行时间追踪分析发现，这一活检过程并未影响胚胎的卵裂率，但是延长了胚胎分裂的时间。因此，经过活检的胚胎在发育上出现延迟，并开始从透明带脱离下来，而未活检的胚胎以较小的形态在透明带中逐渐孵育出来[46](因为活检过程破坏了透明带，所以活检的胚胎无需同未活检胚胎要经历透明带孵出这一过程)。这种胚胎发育阶段和透明带脱离过程的不同步，可能导致D3时移除1个分裂球细胞进行活检的胚胎的临床移植率和持续移植率下降[47]。

综上所述，ART治疗过程中的各项体外操作和体外培养均对ART周期活产率产生了一定的影响，而且这种影响可能是由于ART治疗过程引起配子或胚胎的表观遗传修饰，使得配子或胚胎的基因表达出现异常，从而影响ART周期活产率。