锌指蛋白2在卵巢畸胎瘤中的表达及其临床意义

周广银

(山东省临沂市兰山区人民医院，山东 临沂 276002)

卵巢畸胎瘤是常见的卵巢生殖细胞肿瘤，占全部卵巢肿瘤的20%左右，占生殖细胞肿瘤的80%以上，多发生于育龄期妇女[1]。根据其成熟程度可分为成熟性、交界性及未成熟卵巢畸胎瘤，其中交界性及未成熟卵巢畸胎瘤具有恶性倾向，对患者的生命健康造成极大危害。锌指蛋白2(Zinc finger protein2，Snail2)近年被发现参与多种恶性肿瘤的发生发展，如子宫内膜癌、乳腺癌等[2]。基于此，本研究拟通过检测Snail2在不同分化程度的卵巢畸胎瘤中的表达，并分析与患者临床资料间的相关性，从而明确Snail2与卵巢畸胎瘤的关系，以期为揭示卵巢畸胎瘤恶变机制及临床诊治工作提供新的线索。

1材料与方法

1.1临床资料

临床选取山东省临沂市兰山区人民医院2011年5月至2016年9月收治的98例初发初治的卵巢畸胎瘤患者，病例均经过术中或术后病理检查确诊，且不合并其他器质性疾病及恶性肿瘤。其中成熟卵巢畸胎瘤患者76例，患者年龄19～41岁，平均(27.3±9.2)岁，体重45.5～82.7kg，平均(58.2±10.3kg)；身体质量指数(body mass index，BMI)16.3～32.6kg/m2，平均(21.7±4.4)kg/m2。交界性卵巢畸胎瘤患者13例；患者年龄22～43岁，平均(28.5±11.1)岁，体重51.3～77.6kg，平均(61.2±11.9)kg；BMI 16.8～33.1kg/m2，平均(23.0±6.3)kg/m2。未成熟畸胎瘤患者9例；患者年龄22～37岁，平均(28.3±12.8)岁；体重47.8～75.2kg，平均(60.3±14.1)kg；BMI 15.7～31.4 kg/m2，平均(20.4±6.8)kg/m2。三组患者年龄、体重及BMI指数之间均无显著差异(均P>0.05)，具有可比性。未成熟畸胎瘤患者的TNM分期以2013年国际妇产科联盟(The International Federation of Gynecology and Obst￣etrics，FIGO)发布的《FIGO 2013卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌分期》为标准[3]，Ⅰ期3例(33.33%)，Ⅱ期2例(22.22%)，Ⅲ期4例(44.44%)。

1.2实验材料

主要实验仪器包括：Applied Biosystems 7500 Real-time PCR仪，Bio-Rad S1000 PCR 基因扩增仪，NanoDrop2000超微量分光光度计，Eppendorf 5424r离心机，Eppendorf移液器及对应的Axygen Brand Products加样吸头，Axygen Brand Products 1.5mL离心管等。主要实验试剂包括：国药集团化学试剂有限公司的氯仿、无水乙醇、异丙醇，Thermo Fisher Scientific公司的TRIzol，Fermentas的逆转录试剂盒以及Bio-Rad SYBR Green定量PCR试剂盒。

1.3实验方法

手术取出肿瘤后组织送至病检，留20mg组织-80℃保存，抽提RNA时在组织中加入1mL TRIzol，并在冰上裂解，裂解过程中眼科剪尽量剪碎组织，5分钟后12 000g 4℃离心5分钟，收集上清液至准备好的新离心管中，加入200μL氯仿，震荡混匀后静置5分钟，12 000g 4℃离心15分钟，收集上清液至准备好的新离心管中，加入1mL异丙醇，室温静置10分钟，去上清后75%乙醇清洗沉淀，7 500 g 4℃离心5分钟，尽量吸去上清，室温下风干后20μL ddH2O稀释。超微量分光光度计检测RNA浓度，取1μg行逆转录，所有反应在冰上进行操作，将混合好的反应液1以3μL/孔加入八连管中，加无核酶水至10μL；42℃，配置反应液2，无核酶水定容至20μL；37℃，15分钟后85℃ 5秒，得到的cDNA稀释至500μL。Cyber Green荧光实时定量PCR反应体系检测基因表达水平。反应条件：预变性 94℃4min，扩增条件 94℃ 30秒，60℃ 1 分钟，40个循环。引物情况见表1，内参基因β-actin产物长度286bp，Snail2产物长度249bp。

表1荧光定量引物

Table 1 Fluorescent quantitative primers

Name of primerSequence (5'-3')Snail2(F)GACGCAATCAATGTTTACTCSnail2(R)TAAAGATAATCCTTTCCATGβ-actin(F)CTCCATCCTGGCCTCGCTGTβ-actin(R)GCTGTCACCTTCACCGTTCC

1.4统计学方法

2结果

2.1卵巢畸胎瘤组织中Snail2 mRNA的表达

成熟卵巢畸胎瘤组织相对表达量为0.072±0.027，显著低于交界性瘤0.132±0.049和未成熟卵巢畸胎瘤组织0.171±0.036，差异有统计学意义(F=16.380，Q值分别为5.408、8.335，P<0.05)，交界性与未成熟卵巢畸胎瘤组织Snail2表达无显著性差异(Q=2.261，P>0.05)，见图1。

图1患者临床样本中Snail2 mRNA的表达水平

Fig.1 The expression levels of Snail2 mRNA in clinical samples of patients

2.2卵巢畸胎瘤组织中Snail2的表达与患者年龄、体重、BMI及肿瘤大小的相关性

相关性分析结果显示Snail2 mRNA的表达水平与患者年龄、体重及BMI的相关性无统计学意义(均P>0.05)，与患者肿瘤大小有显著正相关性(P<0.001)，见表2。

2.3卵巢畸胎瘤组织中Snail2的表达与患者TNM分期的相关性

相关性分析结果显示Snail2 mRNA的表达水平与患者TNM分期存在显著正相关性(rs=0.589，P<0.05)。

表2卵巢畸胎瘤组织Snail2表达水平与患者一般资料的相关性

Table 2 The correlation between the expression levels of Snail2 in ovarian teratoma and general data of patients

Snail2表达水平年龄体重BMI肿瘤大小rs0.106-0.173-0.2480.625P0.3670.2400.136<0.001

3讨论

3.1 Snail2在恶性肿瘤中的表达及其生物学意义

Snail2基因位于染色体8q11.21上，其编码的锌指转录蛋白Snail2广泛分布于体内各组织，在正常机体内参与神经嵴细胞的产生和迁移[4]。近年许多研究指出，Snail2参与多种肿瘤的恶变及进展过程：①Snail2在恶性程度较高的基底细胞样型乳腺癌中高表达，可促进乳腺癌细胞上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)进程，并促进乳腺癌细胞干性的维持，加深细胞的恶性程度[5]；②Snail2同样可促进肺癌细胞EMT进程及干性转化，并可促肿瘤细胞的增殖转移能力[6]；③Snail2可促进胃癌细胞EMT进程，并促进胃癌细胞的增殖转移能力；④Snail2可促进结直肠癌细胞HCT116的增殖侵袭能力，并诱导细胞放疗抵抗的形成[7]；⑤Snail2还可抑制前列腺癌细胞中抑癌基因PTEN的表达，促进细胞增殖及侵袭，并可通过激活CXCR4/CXCL12信号通路维持前列腺癌细胞的干细胞特性[8]；⑥Snail2也被发现在宫颈癌中高表达，且促进宫颈癌细胞EMT进程[9]。

3.2 Snail2在恶性肿瘤中的临床意义

Snail2在临床水平也被发现与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关：①Snail2与乳腺癌患者TNM分期及不良预后呈正相关[5]；②非小细胞肺癌患者肿瘤组织高表达Snail2提示患者预后不良[6]；③Snail2的高表达与结直肠癌患者淋巴结转移及不良预后也呈现出显著正相关[10]；④Snail2还可促进前列腺癌去势抵抗的形成，导致患者预后不良[11]；⑤同样在宫颈癌中发现Snail2的表达与患者肿瘤组织的分化程度、淋巴结转移情况、浸润深度、FIGO分期及预后均显著相关[9]，以上结果均提示Snail2的对恶性肿瘤进展的促进作用。

3.3 Snail2在卵巢畸胎瘤中的表达及其临床意义

本研究检测了不同恶性程度卵巢畸胎瘤中Snail2的表达情况，结果显示，分化较好的成熟卵巢畸胎瘤组织Snail2的表达显著低于分化较差的交界性及未成熟卵巢畸胎瘤(P<0.05)，提示Snail2对于卵巢畸胎瘤恶性转变过程中可能发挥重要作用，但交界性卵巢畸胎瘤与未成熟卵巢畸胎瘤Snail2的表达差异无统计学意义(P>0.05)，推测可能是由于样本量不足所致。相关性分析结果显示Snail2与患者肿瘤大小及未成熟卵巢畸胎瘤TNM分期呈显著的正相关性(P<0.05)，提示Snail2对卵巢畸胎瘤的增殖及恶性进展存在明显的促进作用。结合Kaplan-meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=ovar)资料显示的1 306例卵巢癌患者的生存率与Snail2表达水平的相关性，结果显示高表达组卵巢癌患者的生存时间明显少于低表达组(P=0.039)，提示Snail2高表达患者预后不良，见图2。

图2卵巢癌患者的生存率与Snail2表达水平的相关性

Fig. 2 Correlation between the survival rate of ovarian cancer and the expression level of Snail2

综上所述，可以认为Snail2在卵巢畸胎瘤中发挥促癌作用。在进一步的研究中将继续扩大临床样本量，并通过体内体外实验对Snail2与卵巢畸胎瘤的关系进行验证，探究其对细胞恶性转化、增殖、转移及EMT进程的影响，并探索其可能的相互作用分子，揭示Snail2引起卵巢畸胎瘤恶变的确切机制，为临床诊治工作的奠定基础。