微小RNA在女性生殖中的研究进展

丛 晶，王 顺，张多加，彭 艳，张天婵，沈文娟，吴效科

(1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036；2. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040； 3. 黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

微小RNA(microRNA, miRNA)是长度为22～25个核苷酸的非编码单链小RNA，通过与靶mRNA的3’-非翻译端结合在转录后水平上调节基因的表达，其主要作用是降解靶mRNA或抑制其翻译[1]。miRNA作为转录后调节子在细胞增殖、分化、、凋亡及肿瘤发生等生物学过程中发挥着重要的调节作用。在女性生殖方面，miRNA也逐步作为重要的分子生物标志物用于评估卵巢功能胎盘功能、子宫内膜容受性、妊娠检测、胚胎发育以及妊娠并发症[2]。

1 miRNAs在卵巢中的作用

miRNA是卵巢中表达最丰富的小RNA，参与卵泡发育的全过程，包括卵泡的生长、闭锁和排卵。在卵泡发育的不同阶段，miRNAs发挥重要的调节作用。在不同物种的卵巢、卵泡、卵丘细胞、卵丘-卵母细胞复合体以及黄体中均研究了miRNAs的表达情况[3]。

1.1 miRNAs在颗粒细胞的作用

miR-143存在于小鼠初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡的颗粒细胞中。通过转染miR-143抑制剂发现，miR-143沉默能显著增加雌激素的产生和类固醇合成相关基因的表达。体内和体外研究均表明促卵泡激素( follicle stimulating hormone，FSH)能够明显降低miR-143的表达，证实miR-143在FSH介导的雌激素合成以及颗粒细胞增殖中发挥重要作用[4]。

卵母细胞周围颗粒细胞的凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因，而卵泡的加速闭锁可能引起女性生育力下降和卵巢早衰，从而导致不孕[5]。虽然卵泡闭锁的分子机制仍不明确，但研究发现一些miRNAs能通过其靶基因和不同的信号通路调控卵泡闭锁。去乙酰化酶1(sirtuin-1，SIRT1)是小鼠卵巢颗粒细胞miR-22的靶向基因，miR-22通过抑制SIRT1表达来调控颗粒细胞凋亡，从而起到调节卵泡发育的作用[6]。Let-7g是let-7miRNA家族重要成员之一，转化生长因子β受体1(transforming growth factor-β receptor 1，TGFBR1)是猪卵巢颗粒细胞中let-7g新的靶向基因，是TGF-β/SMAD信号通路的重要分子，该信号通路在哺乳动物颗粒细胞增殖和凋亡中发挥作用。Let-7g的过表达能诱发体外颗粒细胞凋亡，抑制TGFBR1 mRNA和蛋白质水平以及SMAD3的磷酸化水平，说明let-7g作为表观遗传调节因子通过与TGF-β/SMAD信号通路的双向负反馈调节作用参与卵巢颗粒细胞的凋亡及卵泡闭锁[7]。在人卵巢颗粒细胞中，miR-23a和miR-27a通过FasL-Fas途径直接靶向SMAD5基因从而促进颗粒细胞的凋亡[8]。

1.2 miRNAs对排卵的影响

miR-200b和miR-429作为miR-200家族成员，能显著影响雌性小鼠生殖功能。miR-200b和miRNA-429特异性敲除的小鼠表现下丘脑-垂体-卵巢轴缺陷，无法排卵。这两个miRNAs的敲除使锌指E盒结合同源盒蛋白1(Zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1)mRNA表达增加。ZEB1蛋白是促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)基因的核抑制因子，能够抑制LH的转录，取消LH峰，从而导致无排卵[9]。后期发现miR-200b和miR-429在人的排卵过程中也发挥作用。无排卵的多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)患者血清中miR-200b和miR-429的表达明显高于自发排卵的女性。这些结果虽然不能确定miRNAs表达改变是导致无排卵的原因，但提示miRNAs可能作为排卵过程的生物标记物，维持正常的排卵功能[10]。

1.3 miRNAs对黄体的影响

黄体是临时的内分泌腺，通过分泌孕酮维持正常妊娠。黄体功能不全导致女性不孕，而黄体功能不全的重要因素就是孕酮分泌下降。Drosha是miRNA合成所特有的重要酶，Maalouf等[11]研究发现Drosha敲除的黄体细胞孕酮合成下降，黄体细胞凋亡增多。认为孕酮的降低可能是由于miRNA直接作用于类固醇合成途径，或是由于凋亡导致细胞减少所致。从黄体形成到黄体功能达到高峰的这一过程中，miRNAs的表达发生改变，说明其可能参与黄体的形成。Maalouf等[12]首次研究了妊娠期母体识别阶段miRNAs对黄体功能的调节作用，发现周期黄体和妊娠黄体中的一些miRNAs表达发生改变。靶向分析这些miRNAs对应的靶向基因，集中于类固醇激素合成、凋亡和免疫反应调节路径，说明在妊娠母体识别过程中，miRNAs表达变化对调节黄体功能和黄体存活有重要作用。

2 miRNAs和卵巢功能紊乱

2.1 miRNAs与PCOS

PCOS是育龄期女性最常见的内分泌代谢疾病之一。研究认为PCOS是由于类固醇激素合成的调节异常，特别是卵巢雄激素分泌异常所致。颗粒细胞中miRNAs可能对参与卵泡发育和卵巢类固醇合成的特定基因有直接的调控作用。Sang等[13]和Roth等[14]分别鉴定了PCOS患者卵泡液上清中的miRNAs，其发现PCOS组与对照组相比miRNAs表达存在差异。前者研究了与类固醇合成有关的7个miRNAs(miR-132、miR-320、miR-24、miR-520c-3p、miR-193b、miR-483-5p和miR-222)，其中miR-132、miR-320、miR-520c-3p和miR-222调节雌二醇的浓度，miR-24、miR-193b和miR-483-5p调节孕酮的浓度。在PCOS组中miR-132和miR-320表达均显著下降。虽然目前这些miRNAs调节孕酮和雌二醇表达以及黄体分泌的机制还不清楚，但通过生物信息学分析发现表达最高的miRNAs靶基因与生殖、内分泌和代谢过程均有关。后者的研究发现5个miRNAs(hsa-miR-9、hsa-miR-18b、hsa-miR-32、hsa-miR-34c和hsa-miR-135a)在PCOS组明显过表达。PCOS组中3个miRNAs靶基因表达显著下降，包括胰岛素受体底物-2、突触-1和白细胞介素-8。这3个靶基因的功能都与PCOS表型有关，包括碳水化合物代谢作用、β细胞功能、细胞与细胞间的连接以及类固醇合成。此外，PCOS患者卵丘细胞中miR-483-5p和miR-486-5p表达下降，其靶基因细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)、血清反应因子(serum response factor，SRF)、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)和叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1，FOXO1)明显增加，miR-483-5p的宿主基因胰岛素样生长因子显著下降，表明miR-483-5p可能对降低胰岛素抵抗发挥重要作用，通过激活PI3K/Akt促进卵丘细胞增殖[15]。这些miRNAs及其靶向基因在卵丘细胞中的差异表达可能解释了PCOS女性卵泡发育异常和不孕的原因。

2.2 miRNAs与卵巢早衰

卵巢早衰指40岁前卵巢功能缺失，导致闭经、雌激素过少、促性腺激素升高，是引起不孕的主要因素。有研究认为，卵巢早衰可能是由于卵巢发育过程中形成的卵泡数降低或是卵泡丢失率增加导致。卵巢颗粒细胞凋亡被认为是卵巢早衰的重要因素，了解其调控机制对卵巢早衰的治疗十分重要。miRNA微阵列分析发现卵巢早衰患者血浆中的miRNAs表达发生改变，其中10个miRNAs( miR-202、miR-146a、miR-125b-2、miR-139-3p、miR-654-5p、miR-27a、miR-765、miR-23a、miR-342-3p和miR-126)在卵巢早衰患者中的表达升高，2个miRNAs(let-7c和miR-144)表达降低[16]。在人卵巢颗粒细胞中，miR-146a通过与靶向基因白介素-1受体相关激酶-1( interleukin-1 receptor associated kinases-1，IRAK-1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)的作用来调节颗粒细胞凋亡，其上调诱发颗粒细胞凋亡，其下调则减少颗粒细胞凋亡[17]。通过研究大鼠卵巢早衰模型miRNAs表达变化揭示了miRNAs在卵巢早衰发生中的分子作用，其中63个miRNAs的表达被上调，20个miRNAs被下调[18]。这些miRNAs的研究结果为临床治疗卵巢早衰等疑难性不孕疾病提供了新的治疗方向，不同物种中miRNAs在卵巢功能中的作用见表1。

表1不同物种中miRNAs在卵巢功能中的作用

Table 1 Function of miRNAs on ovary in different species

表达部位物种作用颗粒细胞小鼠激素合成、颗粒细胞增殖[4]颗粒细胞小鼠颗粒细胞凋亡[6]颗粒细胞猪颗粒细胞凋亡[7]颗粒细胞人颗粒细胞凋亡[8]垂体、血清小鼠、人排卵[9-10]黄体细胞牛黄体细胞凋亡[11-12]卵泡液人类固醇合成[13-14]卵丘细胞人卵泡发育[15]血浆人颗粒细胞凋亡[16]颗粒细胞人颗粒细胞凋亡[17]卵巢大鼠颗粒细胞凋亡[18]

3 miRNAs对子宫内膜容受性的影响

胚胎成功着床依赖于胚胎质量、胚胎与子宫内膜的相互作用以及子宫内膜的容受性，几乎多数着床失败是由于子宫内膜容受性差所致。子宫内膜基质细胞蜕膜化受损容易发生延迟着床，引起早期妊娠失败。因此，基于子宫内膜在着床中的重要作用，进一步了解子宫内膜容受性及其作用机制十分重要。到目前为止，还未出现有效的诊断工具用于准确预测子宫内膜容受性[19]。研究发现一些特定的miRNAs与子宫内膜容受性和子宫蜕膜反应有关。利用miRNA芯片对子宫内膜容受性进行的研究通常分为两类：一是比较育龄期女性增殖期到着床期子宫内膜基因组的动态表达；二是研究生育和不孕女性基因组的表达变化。Kresowik等[20]筛选育龄女性正常月经周期增殖期和分泌期子宫内膜组织和血清中miRNAs的表达。发现一些miRNAs在子宫内膜组织分泌期的表达显著增加，其中miR-31还存在于血清中，认为miR-31可能通过免疫抑制机制作为子宫内膜容受性最佳的生物标志物。在小鼠及人的内膜组织中，容受期前和容受期的miRNAs表达发生改变[21]。miRNA家族包括let-7、miR-30、miR-200、miR-17-92以及miR-494和miR-923均被推测能够调节并促进子宫内膜容受性相关基因的表达[21-22]。研究证实，围着床期子宫内膜-胚胎之间的相互作用受miRNAs的调节，这些miRNAs存在于子宫内膜或胚胎分泌的多泡体中，提示miRNAs可能在胚胎着床过程中发挥作用[23]。

4研究展望

miRNAs在体液和组织中丰富而稳定，作为微创诊断生物标记物具有更广阔的前景，比当下的诊断标记物更敏感更特异。由于miRNAs具有高度的保守性，能很大程度上保持临床样本的完整性，调控生殖疾病的分子表型，评估和监测机体的病理生理状态，已经逐渐作为新的生物标记物应用于转化医学的临床诊断中。自首次报道miRNAs可以作为癌症的生物标记物以来，大量研究已经发现血清/血浆miRNAs的表达随着生理或病理条件的改变发生显著变化。通过血清miRNAs高通量检测筛选出表达差异显著的miRNAs，可作为标记物用以区分PCOS患者和对照组[24]。虽然血清miRNAs可作为评估卵巢功能的生物标记物，但PCOS卵巢组织上表达差异的大多数miRNAs并不能释放到血液中，从而无法在血清中检测到[25]。在未来研究中，还要进一步探讨miRNAs作为女性生殖体统的潜在生物标记物的作用，为确定卵巢储备能力，卵巢内分泌功能，评估促排卵药物的有效性以及胚胎着床的过程提供更多生物信息。此外，miRNAs有望提升生殖系统疾病早期诊断的价值，加速个性化治疗的应用前景，从而解决生殖医学中不断增多的生育问题。