超临界CO2体系下酶法制备中碳链甘三酯的研究

姜 洋 李 丹 王 彤 齐晓芬 张博坤 于殿宇(东北农业大学食品学院，哈尔滨 50030) (哈尔滨普润油脂有限公司，哈尔滨 5008)

超临界CO2体系下酶法制备中碳链甘三酯的研究

姜 洋1李 丹1王 彤1齐晓芬1张博坤2于殿宇1
(东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030) (哈尔滨普润油脂有限公司2，哈尔滨 150028)

中碳链甘三酯作为一种低能量的油脂因其特殊的生理功能和代谢途径得到了广泛的应用，本文以甘油和辛酸、癸酸混合物为原料，研究在超临界CO2体系下酶法制备中碳链甘三酯的工艺条件，并对酯化产物进行分析。通过脂肪酶的比较，得出脂肪酶Novozyme 435优于Lipozyme RM IM，因此，选用脂肪酶Novozyme 435为催化剂，以中碳链甘三酯得率为指标，通过响应面法对工艺条件进行优化，得出最佳反应条件为：反应压力9.1 MPa、反应温度90 ℃、酶添加量4.2%、底物摩尔比3:1和反应时间10.2 h。在此反应条件下中碳链甘三酯的得率为95.1%，酯化率为98.62%。该方法有效的提高了脂肪酸的利用率及MCT得率，所得酯化产物色泽较浅。

超临界CO2体系 酶法 中碳链甘三酯 响应面优化

中碳链甘三酯(MCT)是指由C6～C12饱和脂肪酸所构成的甘油三酯，一般为辛酸甘三酯、癸酸甘三酯或辛酸-癸酸混酸组成的甘三酯[1,2]。大量的研究发现，高脂肪膳食与肥胖症、高血压、高血脂、脑血栓等疾病及某些癌症(乳腺癌、肠癌)发病率的上升存在着密切的关系[3-5]。因此，营养专家不断提倡低油、低糖、低盐、高纤维的“三低一高”饮食原则，而MCT因其特殊的理化功能和代谢途径，作为一种低能量，既具有保健作用又不影响食品风味的膳食脂肪引起了人们的广泛关注[6-10]，且在制备MCT的过程中产生的甘一酯可用作类固醇的溶剂，治疗人体胆结石，对胆汁酸的分泌也有抑制作用，甘二酯可用来制备一些药物的前体及无毒副作用的药物载体[11-12]。

中碳链甘三酯的制备方法主要分为化学法和酶法[13-14]，酶法催化反应，有效避免了化学法中反应过程烦琐，时间长，污染严重等缺点[15-16]，但是酶法制备中碳链甘三酯的产率较低，是目前急需解决的问题。在超临界CO2条件下进行酶催化反应，溶液有较大的溶解能力和较高传递特性，因此降低了反应过程中的传递阻力，能够提高酶反应速率[17-19]；另外CO2是一种无毒、惰性、成本低、可循环使用、对环境相当友好的反应介质[20]。

因此，本研究在超临界CO2体系下制备中碳链甘三酯，探索不同脂肪酶对中碳链甘三酯得率的影响，并对酶法合成中碳链甘三酯进行工艺优化，提高中碳链甘三酯的得率，使其在工业上的具有广阔的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脂肪酶Novozyme 435，Lipozyme RM IM：中国天津诺维信(中国)生物技术有限公司；CO2(纯度≥99.9%)：哈尔滨黎明气体有限公司；辛酸(纯度≥99%)和癸酸(纯度≥99%)：萨恩化学技术有限公司；甘油(分析纯)：国药集团；正己烷：色谱纯，脂肪酸甲酯标准品，美国Sigma公司；其他化学试剂均为分析纯。

高压反应釜：江苏太仓市医器械厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市英峪高科仪器厂；LD4-2A低速离心机：北京医用离心机厂；MK-6S薄层色谱-氢火焰离子检测器：日本三菱公司；GC-6890N型气相色谱仪：美国安捷伦公司；罗维朋比色计：杭州大成光电仪器有限公司；WZS-I阿贝氏折射仪：上海玻璃仪器一厂。

1.2 MCT的合成方法

将辛酸和癸酸按摩尔质量1:1混合，再与甘油按比例加入自制反应釜中，并加入2%蒸馏水(甘油重)，适量的脂肪酶和转子，轻微搅拌均匀后，将反应釜拧紧密封，先向反应釜中充入3～5 MPa CO2，重复2～3次，将釜内的空气置换出去并试漏，然后再充入设定压力的CO2。将充好气的反应釜放入恒温加热磁力搅拌器中，调节转速为200 r/min，在一定的温度下反应一定时间后将产物与酶分离、干燥。

1.3 脂肪酶的筛选

按照1.2方法，选取酯化效果较好的两种脂肪酶Novozyme 435和Lipozyme RM IM[21]，分别在CO2的压力为10 MPa，酶添加量为4%(占脂肪酸总质量)，底物摩尔比3:1(辛酸、癸酸混合酸：甘油)，各自最适温度下进行酯化反应，测其酯化率和MCT得率。

1.4 分析方法

1.4.1 产品组成测定

采用薄层色谱-氢火焰离子检测(TLC-FID)，检测产品中的甘三酯和脂肪酸、甘二酯、甘一酯的相对百分含量[22]。

将样品配制成一定浓度的正己烷溶液，混合均匀，取1 μL溶液点样于色谱柱上，在展开剂中展开，展开剂为正己烷(色谱纯):无水乙醚:冰乙酸=55:15:1(体积比)。分析条件为：氢气流速90 mL/min，空气流速2.0 mL/min，扫柱速度30 s/柱。

1.4.2 脂肪酸含量的测定[23]

取1.2中的液体产物3～5滴，称重，以1% H2SO4-甲醇甲酯化后溶于正己烷，供气相色谱分析。

检测器：FID；进样口温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃；空气压力：50 kPa；氢气压力：60 kPa；氮气压力：220 kPa；程序升温：70 ℃时保持4 min，然后以13 ℃/min的升温速率将温度升至175 ℃，保持此温度27 min，最后以4 ℃/min的升温速率将温度升至215 ℃，保持31 min。

1.4.3 MCT得率的计算

由于TLC-FID的谱图中，甘三酯和游离脂肪酸为同一个峰，所以用谱图中甘三酯和脂肪酸的百分含量减去游离脂肪酸的百分含量即为MCT得率。

1.4.4 MCT酯化率的计算[24]

酯化率是根据反应前后脂肪酸含量的变化进行计算的，能反映出脂肪酸的转化率，计算公式如下所示：

式中：M0为反应初始体系中酸的单位含量；Mt为反应完毕后体系的游离酸的单位含量。

1.4.5 产品物理指标测定

皂化值参照GB/T 5534—2008；酸值参照GB/T 5530—2005；折光指数参照GB/T 5527—2010；碘值参照GB/T 5532—2008；相对密度参照GB/T 5009.2—2003；色泽参照GB/T 5525—2008。

1.5 数据处理

每个实验重复3次，结果表示为平均值±偏差，采用oringe 7.5统计分析软件、Design Expert 7.0.0软件对数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 脂肪酶的选择

由图1可以看出，脂肪酶Novozyme 435和Lipozyme RM IM催化合成MCT的酯化率和MCT得率都随时间的延长而逐渐升高，最终趋于稳定，但是在Novozyme 435的催化下，酯化率和MCT得率明显高于Lipozyme RM IM，而且Novozyme 435催化的酯化反应在10 h时达到平衡，酯化率和MCT得率都达到了最大，分别为97.3%和93.9%，Lipozyme RM IM达到平衡所需要的时间较长，在13 h时酯化率和MCT得率最大，分别为86.3%和81.7%，这可能是由于Lipozyme RM IM是1,3-位特异性脂肪酶，在酯化反应初期，主要生成1,3-甘二酯，再进一步酯化合成甘三酯，所以达到平衡所需的时间较长。综合考虑，Novozyme 435的催化效果较好，因此，选择Novozyme 435为酶法制备合成中碳链甘三酯的催化剂。

图1 不同脂肪酶对合成中碳链甘三酯的影响

2.2 单因素实验

2.2.1 CO2压力对酯化反应的影响

按照1.2的方法，准确称取甘油5 g，按照辛酸、癸酸混合酸:甘油为3:1的比例加入脂肪酸，在反应温度为90 ℃，加酶量4%的条件下，反应10 h，以MCT得率为指标，CO2压力对酯化反应的影响见图2。

图2 CO2压力、时间和温度对酯化反应的影响

压力是超临界酯化反应的主要影响因素，压力不同会影响底物浓度从而影响反应速率及MCT得率。由图2可以看出，随着CO2压力的升高，MCT的得率先上升，后趋于稳定。在压力为7～9 MPa时MCT的得率上升比较明显，而在9～11 MPa时MCT得率上升的幅度比较小，为使MCT得率高，同时又能节约能源，因此，选择CO2压力为10 MPa。

2.2.2 时间对酯化反应的影响

按照1.2的方法，准确称取甘油5 g，按照辛酸、癸酸混合酸:甘油为3:1的比例加入脂肪酸，在CO2压力为10 MPa，反应温度为90 ℃，加酶量4%的条件下，以MCT得率为指标，研究反应时间对酯化反应的影响。结果如图2所示。

由图2可以看出，随着反应时间的延长，MCT得率先逐渐升高，10 h后趋于平稳，这是因为反应底物与酶的接触时间越长，反应越充分，所以MCT得率越高，在10 h时，MCT得率几乎达到最大，为了节省时间和节约能量，因此，选择反应时间为10 h。

2.2.3 温度对酯化反应的影响

按照1.2的方法，准确称取甘油5 g，按照辛酸、癸酸混合酸：甘油为3:1的比例加入脂肪酸，在CO2压力为10 MPa，加酶量4%的条件下反应10 h，以MCT得率为指标，研究温度对酯化反应的影响。结果如图2所示。

由图2可以看出，随着温度升高，MCT得率先逐渐升高，90 ℃时MCT得率最高为94.4%，当温度高于90 ℃时，MCT得率呈下降的趋势。这是因为随着温度的升高，催化剂得以充分还原和活化，且反应物在超临界流体中的溶解度会有很大提高，当温度为90 ℃时，MCT得率达到最大，当温度超过90 ℃时，酶的活性降低，导致MCT得率降低，因此，选择反应温度为90 ℃。

2.2.4 酶添加量对酯化反应的影响

按照1.2的方法，准确称取甘油5 g，按照辛酸、癸酸混合酸:甘油为3:1的比例加入脂肪酸，在CO2压力为10 MPa，反应温度为90 ℃的条件下反应10 h，以MCT得率为指标，研究酶添加量对酯化反应的影响。结果如图3所示。

图3 酶添加量、底物摩尔比对酯化反应的影响

由图3可以看出，随着酶添加量的增加，MCT的得率逐渐升高，在添加量为4%时达到最大，酶添加量超过4%反而有下降的趋势，原因是随着酶用量的增加，酶分子与底物接触的机会增加，反应速度加快，酯化反应程度提高，MCT得率升高，而酶添加量较多时，所需的水分不足，限制了酯化反应的进行，从而使MCT得率有所下降，因此，选择酶添加量为4%。

2.2.5 底物摩尔比对酯化反应的影响

按照1.2的方法，准确称取甘油5 g，按照不同比例加入脂肪酸，在CO2压力为10 MPa，加酶量4%，反应温度为90 ℃的条件下反应10 h，以MCT得率为指标，研究底物摩尔比对酯化反应的影响。结果如图3所示。

底物比是影响中碳链甘三酯含量的主要因素，由图3可以看出，随着底物摩尔比增加，MCT得率呈先上升后下降的趋势，当混合脂肪酸:甘油比例为3:1时，MCT得率最大，这可能是因为在底物摩尔比低于3:1时，甘油过量，酯化过程中会生成较多的甘二酯及甘一酯，导致MCT得率较低；在底物摩尔比超过3:1时，有过量脂肪酸存在，甘油几乎被全部酯化，剩余部分脂肪酸留在酯化产物中，也会导致MCT得率降低。因此，在底物摩尔比为3:1时，正好符合合成甘三酯的摩尔比，选择底物摩尔比为3:1。

2.3 响应面优化工艺参数

依据单因素实验的实验结果，在温度为90 ℃的条件下，根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，采用响应面分析法，以MCT得率为主要的考察指标，利用Design Expert 7.0.0软件在三因素三水平上对超临界CO2体系下酶法制备中碳链甘三酯的影响因素：CO2压力、时间、酶添加量和底物摩尔比进行优化，确定最佳的酯化条件。因素水平及编码见表1，实验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素水平编码表

表2 Box-Behnken实验方案及实验结果

表3 方差分析结果表

表3(续)

注：*显著(P<0.05)，**极显著(P<0.01)。

通过对实验数据进行多元回归拟合，得到MCT得率(R1)对压力(A)、酶添加量(B)、时间(C)和底物摩尔比(D)的回归方程为:

R1=95.10-0.86A+0.54B+0.31C+0.36D+0.38AB-0.5AC+0.4AD+1.2BC-0.2BD-0.43CD-2.04A2-1.31B2-2.34C2-1.61D2

对回归方程求一阶偏导数，当响应值MCT得率(R1)取最大值时，所得四因素最佳水平分别为：压力9.13 MPa，酶添加量4.18%，时间10.21 h，底物摩尔比2.98:1，对应MCT得率最大值为94.406%。

表4 响应面寻优结果

为了检验运用响应面方法分析所得结果的可靠性，按照上述整理值进行实验，得到MCT得率为95.1%。预测值与实验值之间具有良好的拟合性，从而证实了模型的有效性。马传国等[25]采用Lipozyme 435为催化剂，对无溶剂体系中酶促合成中碳链甘三酯进行了研究，得出最适反应时间为16 h，最终MCT得率为92.10%，所以本研究方法反应时间缩短了5.8 h，MCT得率提高了3%。本研究对酯化产物中各组分含量和酯化产物的理化指标进行了分析，结果见表5、表6。

表5 酯化产物中各组分含量

表6 酯化产物的理化指标

由表5、表6可以看出，脂肪酸的转化率达到了98.62%，MCT得率为95.10%，产品的颜色较浅，说明该方法有效的提高了脂肪酸的利用率及MCT得率，且所得产品具有良好的应用潜能。

3 结论

分别将2种脂肪酶Novozyme 435和Lipozyme RM IM应用于超临界CO2体系中制备中碳链甘油三酯，通过对比酯化率和MCT得率，得出Novozyme 435催化的酯化反应在10 h时达到平衡，酯化率和MCT得率都达到了最大，分别为97.3%和93.9%，而Lipozyme RM IM达到平衡所需要的时间较长，在13 h时酯化率和MCT得率最大，分别为86.3%和81.7%。因此，选用Novozyme 435作为催化剂，对超临界CO2体系下酶法制备中碳链甘三酯的工艺条件进行优化，得出最佳反应条件为：反应压力9.1 MPa、反应温度90 ℃、酶添加量4.2%、底物摩尔比3:1和反应时间10.2 h，在此条件下进行酯化反应，得到MCT得率为95.1%，酯化率为98.62%。酯化产物中甘二酯、甘一脂和游离脂肪酸的质量分数分别为1.48%、2.04%和1.38%，且酯化产物的色泽较浅。与在无溶剂体系反应相比[25]，本研究中脂肪酸的利用率提高了0.36%，MCT得率提高了3%，反应时间缩短了5.8 h。

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Enzymatic Preparation of Medium-Chain Triglycerids in Supercritical CO2System

Jiang Yang1Li Dan1Wang Tong1Qi Xiaofen1Zhang Bokun2Yu Dianyu1
(College of Food Science and Technology Northeast Agricultural University1,Haerbin 150030) (Harbin Purun Oil and Fat Co.,Ltd.2,Haerbin 150028)

The medium-chain triglycerids as a low-energy fat have been widely used for their special physiological functions and metabolic pathways.In this paper,glycerin and the mixture of caprylic acid,and capric acid were used as raw materials to study the process conditions of enzymatic preparation of medium-chain triglycerids in supercritical CO2system and the esterification products were analyzed.Through the comparison of lipase,Novozym 435 was superior to Lipozyme RM IM.therefore,withlipase Novozym 435 selected as catalyst and medium-chain triglycerids yield as indicators,the response surface method was used to optimize the process conditions.It turned out that the optimal reaction conditions:reactionpressure，9.1 MPa,reaction temperature，90 ℃,enzyme addition,4.2%,substrate molar ratio,3:1;time,10.2 h.Under the reaction conditions,the medium-chain triglycerids yield was 95.1%,and esterification rate was 98.62%.The method effectively improved the utilization rate of fatty acids and MCT yield and the esterification product is light in color.

supercritical CO2system,enzymatic,medium-chain triglycerids,response surface optimization

TS224.8

A

1003-0174(2017)12-0075-06

“十三五”国家科技支撑计划(2016YFD0401402)，国家自然科学基金(31571880)

2017-01-20

姜洋，女，1992年出生，硕士，粮食、油脂及植物蛋白工程

于殿宇，男，1964年出生，教授，粮食、油脂与植物蛋白工程