基因芯片技术在煤工尘肺合并肺结核中的应用价值

刘建坤 王洪武 陈刚 陈东进 邹珩 张洁莉 周云芝 张楠



基因芯片技术在煤工尘肺合并肺结核中的应用价值

刘建坤1王洪武1陈刚2陈东进3邹珩1张洁莉1周云芝1张楠1

目的 研究基因芯片技术在煤工尘肺合并结核诊断中的应用。方法 所有病人均留取合格痰液，通过基因芯片技术做分枝杆菌菌种鉴定，如为结核分枝杆菌，则做耐药基因检测。结果 结果显示，结核分枝杆菌阳性病人共15人，阳性率为60%，非结核分枝杆菌病人共10人，阳性率为40%，结核分枝杆菌中有1例对异烟肼耐药，耐药率为6.7%。在10例非结核分枝杆菌中，胞内分枝杆菌6例，占60%，结核分枝杆菌复合群1例，占10%，龟脓或脓肿分枝杆菌1例，占10%。结论 胞内分枝杆菌为非结核分枝杆菌主要致病菌种；基因芯片技术具有简便、快速等特点，可准确区分结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌，并可鉴定至种或群，可做耐药监测，可为临床诊断、治疗提供有力的支持。

煤工尘肺；肺结核；基因芯片

资料与方法

一、一般资料

共入选了既往曾接受或正在接受正规抗结核治疗的煤工尘肺病人116人为研究对象，年龄41岁至90岁之间，平均70.1岁，均为男性病人。所有病人晨起留取合格痰液通过基因芯片技术做分枝杆菌菌种鉴定，如为结核分枝杆菌，则做结核分枝杆菌耐药基因检测。

二、煤工尘肺的诊断标准

1986-2002年的病人采用GB5906— 86诊断标准,2002年后的病人采用GBZ70— 2002诊断标准。

三、煤工尘肺合并肺结核的入选条件

已明确诊断煤工尘肺的病人，凡符合一下条件之一者,均可入选:①既往曾行痰涂片或痰培养找到结核分枝杆菌者；②既往痰查结核阴性，但是有活动性肺结核典型胸部X射线表现者；③既往病理学检查，诊断为肺结核者。

四、痰样本采集及处理

以清晨第一口痰为宜。先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰液于无菌样本保存容器1份，密封，由博奥生物有限公司技术人员通过基因芯片技术做分枝杆菌菌种鉴定，如为结核分枝杆菌，则做结核分枝杆菌耐药基因检测。

五、基因芯片检测方法：首先将痰液标本加入1-2倍4%NaOH，振荡混匀，15-20分钟后加入pH 6.8磷酸缓冲液混匀，离心后去上清，沉淀再加入0.5-1ml磷酸缓冲液混匀，接种。吸取等于或大于1个麦氏浊度的菌悬液10-20 μl于含核酸提取液的核酸提取管中，使用Extractor 36核酸快速提取仪振荡5分钟，95℃水浴5分钟，5000 rpm离心1分钟，得到核酸。然后配制PCR反应体系，进行PCR扩增反应。将杂交缓冲液于50℃加热使其完全融化，充分混匀后，在微量离心机中瞬时离心，按9 μl/管分装。每管加入6 μl相应的PCR产物。将杂交反应混合物加热至95℃(置于PCR仪或水浴锅中)变性5 分钟。杂交反应混合物变性完毕取出后，立即浸入冰水混合物中冰浴3分钟。将杂交反应混合物从冰浴中取出，用微量移液器吹吸2次混匀，待白色絮状沉淀(如有)消失后，经盖片的加样孔加入13.5 μl杂交反应混合物，迅速盖上杂交盒并密封。每个微阵列限加一份样品，记录芯片编号、微阵列位置及对应的样品编号。立即将密封好的杂交盒水平放入50℃预热的恒温水浴锅中。待杂交盒全部放入后计时120分钟。杂交反应结束后，将杂交盒水平取出拆开，将芯片取出，进行芯片洗涤。然后于离心机中800 rpm离心5分钟，甩干后扫描。最后使用LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪和相应软件进行信号的读取及结果判读。

结 果

共入组116人，检测出结核分枝杆菌为15人，占所有阳性人数的60%，非结核分枝杆菌共10人，占所有阳性人数的40%，总体阳性率为21.6%。结核耐药情况：共做耐药检测15人次，其中有1人对异烟肼耐药，其余对异烟肼及利福平均敏感，耐药率为6.7%。(耐药检测结果)。

表1 基因芯片检测分枝杆菌病原菌分布

表2 耐药菌检测结果

表3 基因芯片技术检测非结核分枝杆菌病原菌情况

有2例未判，是因为低于测序灵敏度。

讨 论

在临床上，肺结核患者痰查结核分枝杆菌的阳性率偏低，而煤工尘肺并发肺结核的患者,痰查结核分枝杆菌阳性率更低。如何能提高痰查结核分枝杆菌的阳性率已成为临床亟须解决的课题之一。该研究利用基因芯片技术检测煤工尘肺合并肺结核患者，阳性率达21.6%。这与既往的研究结果相一致。Jeda A等[2]发现基因芯片检测灵敏度比PCR电泳法高10倍。该研究使用博奥生物有限公司提供的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法)，检测灵敏度为1×103个菌/PCR反应。这与唐曙明等[3]的研究结果相一致，提高了结核分枝杆菌检测的灵敏度。

该研究同时发现非结核分枝杆菌的发病率较高，占所有阳性人数的40%。这与既往研究成果相一致，我国结核病流行病学调查资料显示非结核分枝杆菌分离率2010年高达22. 9%[1]，李昕洁等[4]也发现在临床上非结核分枝杆菌的分离率较高，反映出我国当前非结核分枝杆菌感染率呈明显上升的趋势。

该研究结构显示，在现有的煤工尘肺合并非结核分枝杆菌感染的病人中，胞内分枝杆菌所占比例为60%。这与Herndndez—Gardufio[5]、黄明翔等[6]的研究结果相一致。非结核分枝杆菌菌种快速、准确鉴定对于临床疾病的诊断和治疗具有重要意义，美国2007年“非结核分枝杆菌病诊断、治疗与预防的指南”[7]中明确指出临床分离的非结核分枝杆菌必须鉴定到菌种水平。因此如何能够快速、准确地对致病性分枝杆菌做出诊断，是有效预防分枝杆菌病的发生、有效控制病情传播的重要手段。传统的结核分枝杆菌检测方法主要有涂片抗酸染色法、罗氏培养基培养法和结核抗体金标法，其中抗酸染色涂片法简便、快捷、价格低廉，但是敏感性低，不能区分结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌；罗氏培养基培养法耗时(2-8周)；结核抗体金标法则只能检测结核分枝杆菌，而不能检测非结核分枝杆菌检测。

该研究所采用的博奥生物有限公司提供的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法)则能同时检测结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌，是针对临床常见的分枝杆菌设计特异性的PCR扩增引物及种属特异性寡核苷酸探针，可鉴定出被测细菌的种类。除痰液外，脓液、分泌物、肺泡灌洗液、穿刺液(包括脑脊液、胸腹水、心包液、关节液、胆汁等)、尿液等标本均可使用该试剂盒检测，另外该试剂盒检测耗时短，只需6-8小时即可出结果。

随着一线药物的使用，耐多药结核分枝杆菌的感染有日益增多的趋势。据WHO统计，肺结核位于传染病死亡原因的第一位，耐药菌株流行是结核病控制难度增加的主要原因[8-9]。耐多药结核分枝杆菌是指患者感染的结核分枝杆菌在体外对异烟肼和利福平耐药。煤工尘肺患者是肺结核的好发人群，全国尘肺流行病学调查结果报告尘肺结核合并率为19.35%[10]。因为煤尘对巨噬细胞的细胞毒作用，使大量巨噬细胞变性、坏死、崩解，加之外周血中T淋巴细胞减少，对结核分枝杆菌的吞噬、清除能力下降； 另外煤工尘肺病人晚期可出现肺间质纤维化，导致循环血容量不足，抗结核药物不易达到病灶部位，难以达到有效杀菌浓度，以上各种原因综合起来导致耐多药结核分枝杆菌感染率日益增高。该研究因入选病人较少，15人次中共有1例对异烟肼耐药，阳性率为6.7%，结果不具有代表性，但是也提示耐药的严重性。

该研究所采用的博奥生物有限公司提供结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法)，该试剂盒可检测利福平及异烟肼的3个耐药相关基因rpoB基因、katG基因及inhA基因启动子的野生型及不同突变型，检测灵敏度为1×103个菌/PCR反应，该试剂盒检同样只需6-8小时即可出结果。

综上所述，煤工尘肺病人是肺结核的高发人群，同时肺结核分枝杆菌的发病率逐年升高，在现有的煤工尘肺合并非结核分枝杆菌感染的病人中，胞内分枝杆菌所占比例为60%，为人类主要的非结核分枝杆菌致病性菌种；耐药菌株流行是结核病疫情日趋严重的主要原因。基因芯片技术用于分枝杆菌的检测具有简便、快速、灵敏度高等特点，可准确区分结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌，并可鉴定至种或群，可做耐药监测，可为临床诊断、治疗提供有力的支持。

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Diagnostic value of gene clip for coal workers’ pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis

LIUJian-kun,WANGHong-wu,CHENGang,CHENDong-jin,ZOUHeng,ZHANGJie-li,ZHOUYun-zhi,ZHANGNan

ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028,China

Objective To explore the diagnostic value of gene clip for coal workers’ pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis. Methods All the patients were used to detect Mycobacterium tuberculosis by gene clip. Mycobacterium strains isolated from all the patients were identified by drug-resistant genes. Results 15 strains of Mycobaterium isolated were M.tuberculosis, accounting for 60%. 10 strains were non-tuberculosis Mycoberium, accounting for 40%. In the 15 strains of M.tuberculosis, 1 strain was resistant to isoniazid (6.7%). 6 strains were M. intracellulare of all the non-tuberculosis Mycobacterium (60%). 1 strain was M.tuberculosis complex group, accounting for 10%. 1 strain was M. chelonae (10%). 2 strains were non-tuberculosis Mycobacterium, but they couldn’t be identified. Conclusion Of all the coal workers’ pneumoconiosis complicated with non-tuberculosis Mycobacterium, the main strain is M. Intracellulare. The gene clip is simple, rapid, sensitive and specific for detecting tuberculosis. It could diagnose M.tuberculosis and non-tuberculosis Mycoberium and monitor drug resistance, which could be taken as a helpful method for diagnosis and treatment of pulmonary tuberculosis.

coal workers’ pneumoconiosis; pulmonary tuberculosis; gene clip

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.01.009

1. 100028 北京 煤炭总医院呼吸内科 2. 066000 河北 秦皇岛 国家煤矿安全监察局尘肺病康复中心尘肺科 3. 102300 北京 北京京煤集团总医院结核病科

煤工尘肺在我国已经成为严重威胁煤矿工人健康的一种主要职业病。煤工尘肺患者是肺结核的好发人群，但是由于煤工尘肺结核在临床表现上无特异性，且非结核分枝杆菌的感染率逐年提高[1]，所以早期诊断与治疗煤工尘肺结核，已经成为延缓煤工尘肺病情进展为一种重要手段。我们入选了既往曾接受或正在接受正规抗结核治疗的煤工尘肺病人116人为研究对象，通过相关研究,了解基因芯片技术及其在煤工尘肺合并肺结核中的应用价值，为制定有效的防治措施提供依据。

2016-05-19]