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ADAM33基因T1位点多态性与内蒙古地区蒙、汉民族人群哮喘的相关性研究

2017-12-23朱淑芬纳仁高娃

临床肺科杂志 2017年1期
关键词:蒙古族汉族等位基因

朱淑芬 纳仁高娃



ADAM33基因T1位点多态性与内蒙古地区蒙、汉民族人群哮喘的相关性研究

朱淑芬1纳仁高娃2

目的 探讨解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)基因T1位点(rs2280091)不同基因型及等位基因的分布频率与内蒙古地区蒙、汉民族支气管哮喘的关系。方法 选用限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对汉族哮喘患者112例、蒙古族哮喘患者105例进行ADAM33基因多态性的检测,并分别与110例健康汉族和108例健康蒙族进行比较,筛选有意义基因。结果 内蒙古地区蒙、汉族人群均可检出T1位点3种基因型(AA、AG、GG),在蒙、汉族支气管哮喘组分布频率分别与健康对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),汉族哮喘组AG、GG基因型OR值分别为0.183、 0.38,蒙古族哮喘组AG、GG基因型OR值分别为 0.295 、 0.851;蒙、汉族支气管哮喘组T1位点等位基因A和G基因频率分别与健康对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),G等位基因OR值及95%可信区间分别为0.372(0.190-0.729)、0.237(0.111-0.509)。结论 内蒙古地区ADAM33基因T1位点基因多态性与内蒙古地区蒙、汉族人群哮喘发病可能相关。

解整合素-金属蛋白酶33; 哮喘; 基因多态性; PCR-RFLP;蒙族;汉族

支气管哮喘简称哮喘,是常见的慢性气道疾病之一,因其发病机制复杂,涉及免疫、遗传、环境等诸多因素,故在基因学角度,寻找易感基因至关重要。解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)基因是近年来哮喘发病的研究热点[1]。因此本课题使用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对内蒙古地区蒙、汉民族人群支气管哮喘患者与ADAM33基因T1位点多态性关系进行研究,进一步从免疫遗传学角度探讨蒙、汉民族支气管哮喘发病的遗传学特征。

资料与方法

一、研究对象

选择2014-2015年就诊于内蒙古医科大学附属医院门诊及住院部的蒙古族、汉族支气管哮喘患者(分别为105例、110例)为病例组,其中汉族哮喘组,男60例,女50例,最小年龄22岁,最大年龄80 岁,平均年龄(44±12.7)岁;蒙古族哮喘组,男54例,女51例,最小年龄17岁,最大年龄75岁,平均年龄(37±10.5)岁。收集病例均符合2008年中华医学会呼吸分会哮喘学组修订的哮喘诊断标准[2]。并选同期健康体检的蒙、汉族人群(分别为108例、112例)作为对照,研究对象年龄、性别构成,比较差异无显著性(P<0.05)。入选人员均符合祖籍三代及三代以上居住在内蒙古地区无血缘关系、无异族通婚史,无过敏性疾病病史,无高血压、糖尿病等慢性基础疾病、无肿瘤、自身免疫性疾病及其它家族性遗传疾病的病史。

二、方法

1 基因组DNA提取:采患者外周静脉血2mL,EDTA(INSEPACK,ST520EK)抗凝,采用全血基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP348-02)提取DNA。

2 引物: T1位点(rs2280091)引物序列,上游引物: 5'-ACTCAAGGTGACTGGGTGCT-3'下游引物: 5'-GAGGGCATGAGGCTCACTTG-3,扩增片段长度大约为400bp,由上海生物工程公司合成。

3 PCR扩增:PCR反应体系总体系为20μL,包括:基因组DNA 1μL,Extaq Mix 10 μL,上、下游引物各1μL,ddH2O 7 μL;PCR 反应条件: 95 ℃预变性5 min,95℃ 变性20 s,68℃ 退火20s,72℃延伸30s,共35个循环,72℃终末延伸5min。PCR产物经2%琼脂糖电泳检测。

4 限制性片段长度多态性检测: T1位点检测使用限制性内切酶NcoI酶进行。酶切体系: 总体系为20μL,扩增的PCR反应产物10μL,限制性内切酶0.5μL,ddH2O 7.5μL,10×NEBuffer液2μL,37 ℃放置1小时;65℃放置20分钟。酶切产物经3%的琼脂糖凝胶进行电泳,电压为120V,时间为30 min,然后放入凝胶成像仪中保存结果,进行图像分析。

5 DNA序列测定:将扩增好的PCR片段送往上海英俊生物技术有限公司行DNA序列测定。

三、统计学方法

结 果

一、T1 位点的基因型检测结果

1. T1位点突变类型为A/G。AA基因型:可被NcoI酶完全酶切,酶切产物片段长度分别为144bp和256bp;AG基因型:可被部分酶切,得到3个片段,长度分别为144bp、256bp和400bp,GG基因型:不可被酶切,产物长度为400bp,(见图1)。

图1 T1引物PCR产物NcoI酶切电泳图

1泳道为Marker DL500, 2、5泳道为纯合GG基因型;3、6泳道为纯合AA基因型;4、7泳道为杂合AG基因型

2. T1位点基因测序,见图2。

二、汉族哮喘与健康汉族人群比较

表1 汉族哮喘与健康汉族人群ADAM33基因T1位点基因型分布频率和等位基因频率比较[n(%)]

T1基因型及等位基因健康汉族(n=110)汉族哮喘(n=112)χ2POR95%CIAA79(71.82)104(92.85)1AG29(26.36)7(6.25)0.1830.076-0.440GG2(1.82)1(0.9)17.1760.0000.380.340-4.264A187(85.00)215(95.98)G33(15.00)9(4.02)15.6300.0000.2370.111-0.509

汉族哮喘组与健康汉族组的ADAM33 基因T1位点的基因型频率、等位基因频率两组比较差异有统计学意义。

图2 以上测序图箭头所示AA型.AG型.GG型

三、蒙古族哮喘与健康蒙族人群比较

蒙古族哮喘组与健康蒙古族组的ADAM33 基因T1位点的基因型频率、等位基因频率两组比较差异有统计学意义。

四、健康蒙古族与健康汉族人群比较

表2 蒙古族哮喘与健康蒙族人群ADAM33基因T1位点基因型分布频率和等位基因频率比较[n(%)]

T1基因型及等位基因健康蒙古族(n=108)蒙古族哮喘(n=105)χ2POR95%CIAA80(74.07)94(89.52)1AG26(24.07)9(8.57)0.2950.130-0.665GG2(1.85)2(1.91)9.3430.0090.8510.117-6.180A186(84.93)197(93.81)G33(15.07)13(6.19)8.8270.0030.3720.190-0.729

表3 健康蒙古族与健康汉族人群ADAM33基因T1位点基因型分布频率和等位基因频率比较[n(%)]

T1基因型及等位基因健康蒙古族(n=108)健康汉族(n=110)χ2PAA80(74.07)79(71.82)AG26(24.07)29(26.36)GG2(1.85)2(1.82)0.1520.927A186(84.93)187(85.00)G33(15.07)33(15.00)0.0000.984

健康蒙古族与健康汉族人群各等位基因及基因型频率比较,差异均无统计学意义。

五、汉族哮喘与蒙古族哮喘患者比较

蒙古族与汉族哮喘人群各等位基因及基因型频率比较,差异均无统计学意义。

讨 论

ADAM33的mRNA表达具有一定的组织特异性,主要表达于肺的平滑肌细胞和成纤维细胞,它可能与小气道重塑、高反应性及炎症等有关[3]。由于人类ADAM33基因的多态性、研究对象的人种、民族和地区差别以及实验方法不同等原因,国内外研究报道不尽相同。

表4 汉族哮喘与蒙古族哮喘人群ADAM33基因T1位点基因型分布频率和等位基因频率比较[n(%)]

T1基因型及等位基因蒙古族哮喘(n=105)汉族哮喘(n=112)χ2PAA94(89.52)104(92.85)AG9(8.57)7(6.25)GG2(1.91)1(0.9)0.8630.649A197(93.81)215(95.98)G13(6.19)9(4.02)1.0630.302

最先发现哮喘与ADAM33基因T1位点具有强关联的是Van Eerdewegh[4]等,随后Young Ho Lee等在对亚洲人群ADAM33基因多态性进行分析,也发现T1位点与哮喘有关[5]。我国学者邱玉明[6]、Chiang[7]等发现T1 位点基因型频率及等位基因分别在哮喘组和对照组中比较,差异均具有统计学意义。但Schedel和Werrner等[8-9]在德国人群中却未发现T1位点与哮喘相关。我国皖南地区、广州市儿童中也未发现 T1与哮喘有相关性[10-11]。目前在我国少数民族中,对新疆维吾尔族[12]及广西壮族哮喘人群有所研究,发现哮喘均与T1的多态性相关,故不排除ADAM33基因多态性与地区、民族的差异有关,故本课题通过对内蒙古地区蒙、汉族人群进行ADAM33 T1基因型、等位基因分析,进一步阐述其与哮喘的相关性。

本项实验首次对我国内蒙古地区汉族、蒙古族哮喘人群的ADAM33 基因T1位点进行了对比研究,对蒙、汉民族病例组和对照组T1位点的基因型和等位基因进行了统计,发现汉族与蒙古族健康人群及哮喘人群分布无统计学意义,及民族间无差异。但证实了ADAM33基因T1位点多态性与内蒙古地区蒙古族、汉族支气管哮喘的发病率均具有相关性。对于T1位点,AA 为野生型、AG 为突变杂合子、GG 为突变纯合子,在汉族哮喘组分布为104(92.85%)、7(6.25%)、1(0.9%), 在对照组分布为79(71.82%)、29(26.36%)、2(1.82%), χ2=17.176,P<0.05, 差异有统计学意义。汉族哮喘组ADAM33 基因T1位点等位基因A和G 的频率分别为95.98%、4.02%; 对照组ADAM33 基因T1位点等位基因A 和G 分别为85%、15%。汉族哮喘组与对照组等位基因频率比较差异有显著性(χ2=15.630,P<0.05) 。在蒙古族哮喘组AA、AG及GG3种基因型分布为94(89.52%) 、9(8.57%) 、2(1.91%) , 在对照组分布为80(74.07%)、26(24.07%)、2(1.85%),χ2=9.343,P<0.01, 差异有显著性。蒙古族哮喘组ADAM33 基因T1位点等位基因A和G 的频率分别为93.81%、6.19%; 对照组ADAM33 基因T1位点等位基因A 和G的频率分别为84.93%、15.07%。蒙古族哮喘组与对照组A 及G 等位基因频率比较差异有显著性(χ2=8.827,P<0.05) 。汉族哮喘组AG、GG基因型OR值分别为0.183、 0.38,蒙古族哮喘组AG、GG基因型OR值分别为0.295、0.851;蒙、汉族支气管哮喘组,G等位基因OR值及95%可信区间分别为0.372(0.190-0.729)、0.23(0.111-0.509),可见内蒙古地区蒙、汉族哮喘患者T1位点的基因型及等位基因多态性与哮喘发病相关,等位基因A可能为哮喘风险基因,等位基因G可能为保护基因。本实验与国外很多学者及我国广西壮族、台湾地区等研究结果一致,但也与部分研究结果不同,考虑虽与地域、民族、种族差异有关,但不排除与所选样本不同、检测方法不同所引起,需扩大样本进一步研究。

综上所述, ADAM33 基因 T1位点多态性存在于内蒙古地区人群中,ADAM33 基因T1位点可能在中国内蒙古地区蒙古族、汉族哮喘人群中发挥作用。

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Association between polymorphism of T1 locus allele in ADAM33 gene and bronchial asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population

ZHUShu-fen,NARENGao-wa

DepartmentofICU,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430071,China

Objective To explore the association of the polymorphism of T1 locus allele (rs2280091) in recombinant A disintegrin and metalloprotease 33 ADAM33 gene with bronchial asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population. Methods 112 screened Han population patients with asthma (the asthma group A) and 110 unrelated healthy Han population (the healthy control group A) were selected. 105 screened Mongolian population patients with asthma (the asthma group B) and 108 unrelated healthy Mongolian population (the healthy control group B) were selected. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used to determine polymorphism of T1 locus allele in ADAM33 gene in all groups. Results Three genotypes (AA, AG and GG) were found in Inner Mongolia Han and Mongolian population. The differences of distribution frequency in the Mongolia, Han bronchial asthma groups were significant while compared with the control group (P<0.05). The OR value of AG and GG genotype was 0.183 and 0.38 in the asthma group A, and 0.295 and 0.851 in the asthma group B. There were significant differences in T1 gene frequency loci alleles A and G between the bronchial asthma groups and the control group (P<0.05). The OR value and the 95% confidence of G allele interval was 0.372 (0.190-0.729) in the asthma group B, and 0.237 (0.111-0.509) in the asthma group A. Conclusion T1 ADAM33 gene locus gene polymorphism is associated with asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population.

ADAM33; asthma; gene polymorphism; polymerase chain restriction fragment length polymorphism; Mongolian nationality; Han nationality

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.01.018

内蒙古自治区自然科学基金(No 2014MS08122)

1. 010050 内蒙古 呼和浩特,内蒙古医科大学附属医院重症医学科

2. 010050 内蒙古 呼和浩特,内蒙古医科大学

2016-06-20]

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