新合成季铵盐单体化合物的体外抗菌和体内抗炎活性*

师莹莹，侯桂琴，赵 琦，王 洋，任彦丹，张梦影，鲁照明

新合成季铵盐单体化合物的体外抗菌和体内抗炎活性*

师莹莹，侯桂琴，赵 琦，王 洋，任彦丹，张梦影，鲁照明#

季铵盐单体；抗菌活性；抗炎作用

目的：观察新合成的4个季铵盐单体化合物的体外抗菌和体内抗炎活性。方法将合成的4种季铵盐单体分别配制成高、中、低剂量的液体和固体制剂。检测其液体制剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及沙门菌的体外抗菌活性。用家兔对筛选出的化合物进行皮肤刺激性实验。将涂抹和未涂抹化合物的普通导尿管放置于家兔尿道5、10、15 d后，ELISA法测定家兔血浆中IL-10 和TNF-α水平；放置15 d后HE染色观察尿道炎症细胞的生成情况。结果体外抗菌活性测定结果显示，化合物2和4对3种细菌均有较好的抑制作用(P<0.05)，而化合物1和3对3种细菌的抑制作用不明显。皮肤刺激性实验结果显示，化合物2和4对家兔皮肤均无刺激性；同一时间点，化合物2和4组家兔血浆IL-10水平明显高于对照组，而TNF-α 水平明显低于对照组(P<0.05)；HE染色结果显示，化合物2和4组家兔尿道黏膜组织中炎症细胞数及其浸润能力均低于对照组。结论季铵盐单体化合物2和4具有较好的体外抗菌活性和体内抗炎活性。

导尿管相关尿路感染(catheter-related urinary tract infections, CAUTI)是医院获得性感染的第二大原因[1-2]，因其发生率高且会引起如膀胱炎、心内膜炎、脑膜炎等各种并发症，严重影响患者的生活质量及健康[3]。目前临床上通过应用抗菌导尿管来降低CAUTI的发生率[4-5]，但大多市售的抗菌型导尿管抗菌持续时间短，易使细菌产生耐药性，因此急需开发更加安全、长效的抗菌型医用导尿管。作者以甲基丙烯酸二甲氨基乙酯[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, DMAEMA]和对氟苄氯为原料，通过亲核反应制得带有不饱和键的一系列季铵盐单体，对其体外抗菌活性和在家兔体内的抗炎活性进行了评价，并观察了其皮肤刺激性，为后期把抗菌性季铵盐单体与乳胶接枝，最终开发抗菌型乳胶材料提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 试剂 4种季铵盐单体化合物均由郑州大学药学院临床药学系合成，合成过程见图1。将4个化合物分别以生理盐水和凡士林为溶剂配置成低(2 g/L)、中(6 g/L)、高(10 g/L)3个剂量的液体和固体制剂。青霉素钠购自上海新先锋药业有限公司，以生理盐水为溶剂配制成10 g/L的溶液作为阳性对照。白介素10(IL-10)及肿瘤坏死因子(TNF-α) ELISA检测试剂盒购自美国R&D Systems公司。

图1 4种季铵盐单体化合物合成过程

1.1.2 细菌及实验动物来源 3种尿路感染常见菌沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌由郑州大学药学院微生物与生化药学系提供。普通级日本大耳白兔购自河南康达实验动物有限公司，动物生产许可证号为SCXK(豫)2016-0002。实验动物适应性饲养7 d，自由饮食饮水，昼夜循环。

1.2体外抗菌活性观察将4 mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌3种菌液分别接种至经高压蒸汽(121 ℃)灭菌30 min的试管中，37 ℃振荡培养2 h，分别加入10 μL低、中、高剂量受试化合物液体制剂及80 μL青霉素钠阳性对照，则化合物终质量浓度分别为0.005、0.015和0.025 g/L，青霉素钠终质量浓度为0.2 g/L。培养24 h后，用紫外分光光度计测定菌液的OD值。用未加化合物的菌液作为空

白对照。每个剂量重复3次。

1.3皮肤刺激性观察①单次给药皮肤刺激性：将雄性家兔背部皮肤去毛，左右各2块，对称分布，去毛范围3 cm×3 cm，每块间隔2～3 cm。24 h后分别将受试化合物固体制剂涂抹于脱毛区，4个区域分别涂抹化合物的高、中、低剂量制剂及凡士林对照，每只家兔涂抹一种化合物，每种化合物涂抹3只家兔。然后用医用纱布覆盖，以无刺激性胶布固定，24 h后用温水清洗敷药部位，于涂药前及去除药物后第6、12、24 和48 h观察涂药处皮肤有无红斑、水肿、出血点等情况，根据国家食品药品监督管理局发布的《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中皮肤刺激性反应评分标准进行刺激性评分，0.00～0.49分为无刺激性，0.50～2.99分为轻度刺激性，3.00～5.99分为中度刺激性，6.00～8.00分为强刺激性。②多次给药皮肤刺激性：家兔脱毛和涂药方法同上。给药1次/d，连续7 d，每次给药前用温水清洗敷药部位。分别于第2、4、6和8天观察记录涂药处皮肤有无红斑、水肿、出血点等情况，评分方法同上。

1.4体内抗炎活性观察将受试化合物高剂量固体制剂涂抹导尿管(普通医用F8导尿管，购自江西博美斯特医疗科技股份有限公司)上，分别插入家兔尿道，然后将导尿管剪短至其没入尿道；用涂抹凡士林的导尿管作为对照；每种受试化合物使用6只家兔。分别于导尿管留置后第5、10及15 天耳缘静脉采集家兔静脉血[6-7]，用ELISA法测定炎症因子IL-10及TNF-α。导尿管留置15 d后剥离家兔尿道，组织标本经40 g/L中性多聚甲醛固定48 h后脱水，石蜡包埋并切片，HE染色观察炎症细胞生成情况。

1.5统计学处理运用SPSS 21.0处理和分析数据，各组菌液OD值的比较采用单因素方差分析，3组家兔血浆炎症因子水平的比较采用重复测量数据的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1体外抗菌活性各化合物处理金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌24 h后菌液OD值结果见表1～4。与空白对照组相比，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌经化合物2、4和青霉素钠处理24 h后，菌液OD值均降低，提示化合物2和4具有明显的抗菌活性。

表1 化合物1处理后3种菌液的OD值

*:与空白对照组比较，P<0.05。

表2 化合物2处理后3种菌液的OD值

*:与空白对照组比较，P<0.05。

2.2药物皮肤刺激性根据体外抗菌活性实验结果，筛选出化合物2、4进行后续实验。将家兔皮肤涂药24 h后去除药物，并在涂药前及去除药物后第6、12、24、48 h观察皮肤刺激反应，家兔皮肤均未出现明显红斑、水肿等反应，评分均为0。多次给药后连续观察7 d，家兔给药侧皮肤也未见明显红斑、水肿及其他皮肤反应，评分均为0。高剂量化合物单次(图2)及多次给药前后家兔皮肤未出现刺激性反应。提示化合物2和4对皮肤均无刺激性。

2.3体内抗炎活性

2.3.1 血浆IL-10和TNF-α测定的结果 见表5、6。

表3 化合物3处理后3种菌液的OD值

*:与空白对照组比较，P<0.05。

表4 化合物4处理后3种菌液的OD值

*：与空白对照组比较，P<0.05。

化合物2、4涂抹的导尿管留置后家兔血浆TNF-α水平较对照组降低，血浆IL-10水平较对照组升高，化合物4组的变化程度大于化合物2组。

2.3.2 组织学观察 导尿管留置15 d后，3组家兔尿道黏膜组织HE染色结果见图3。对照组尿道组织中可见大量慢性炎症细胞浸润，个别炎症细胞向上侵入到尿路上皮底层。与对照组相比，化合物4组的慢性炎症细胞浸润明显较少；而化合物2组尿路上皮细胞排列较整齐，仅见少量以浆细胞为主的炎症细胞浸润。提示化合物2和4在体内均有较好的抗炎活性，尤其2号抗炎活性更高。

A：化合物2；B：化合物4；1～5：涂药前及去除药物后第6、12、24、48 h。图2 单次给药家兔皮肤刺激性实验结果

组别导尿管留置时间第5天第10天第15天对照组24．56±2．3338．64±5．2445．63±4．35化合物2组8．64±2．2415．45±3．2320．32±2．54化合物4组7．56±1．8813．26±2．4518．56±3．24

F时间=51.215，F组间=494.570，F交互=27.301，P均<0.001。

表6 家兔血浆 IL-10水平的比较(n=6)

F时间=20.953，P=0.002；F组间=141.312，P<0.001；F交互=2.551，P=0.094。

A：对照组；B：化合物2组；C：化合物4组。图3 导尿管留置15 d后尿道黏膜组织HE染色结果(100×)

3 讨论

尿路感染在医院尤其是ICU的发生率极高，而70%～80%的尿路感染都是由长期留置导尿管所引起，严重影响患者的生活质量和生命安全[8-9]。因此，开发新型抗菌型导尿管，从而降低由长期留置导尿管引起的感染发生率是必要的。

季铵盐类抗菌剂是目前研究较多的一类有机抗菌剂，具有高效、优异的杀菌功效。其抗菌机制主要是带正电的季铵盐化合物可吸附带负电荷的细菌并作用于细菌细胞壁上的膜蛋白，使之变性，从而损坏原有的膜内物质运输功能和代谢功能，杀灭细菌[10]。若能将具有抗菌活性的季铵盐化合物单体与乳胶接枝，开发具有抗菌活性的乳胶材料，将其制成具有抗菌活性的导尿管，将会有很好的临床价值。山西理工大学张利等[11]也对此方面进行了相关研究。

本研究中，作者首先对前期合成的4个季铵盐单体化合物的抗菌活性进行了测定。体外抗菌活性测定结果显示，化合物2和4对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用，对大肠杆菌、沙门菌也具有一定的抗菌作用；家兔皮肤刺激实验证实化合物2、4对皮肤没有明显刺激作用，故选择化合物2、4进行进一步观察，对二者的体内抗炎活性进行了分析。

TNF-α 为体内炎症促进因子[12]，IL-10 为炎症抑制因子[13]，二者是一对相互调节的细胞因子，共同作用，介导着炎症的发展[14]。当尿道留置导尿管后，炎症反应逐渐启动。一方面活化的巨噬细胞分泌TNF-α等炎症促进因子，引起血管内皮细胞和白细胞的黏附，诱发炎症反应，导致组织损伤；另一方面分泌IL-10等炎症抑制因子，抑制炎性细胞的激活与迁移，抑制炎症因子的合成与释放[15-16]。本研究中作者将化合物2和4涂抹于导尿管并将其留置于家兔尿道，测定留置不同时间时家兔血浆TNF-α和IL-10水平。报道[15-16]证实，炎症的发生有一个过程，在留置导尿管的前几天家兔体内炎症因子水平无明显变化，对炎症因子的测定可在几天后进行，故该研究未测定初始炎症因子的水平，仅比较了留置导尿管后不同时间点的炎症因子表达。本研究实验结果显示，在同一时间点，化合物2和4组家兔血浆IL-10水平明显高于对照组，而TNF-α 水平低于对照组，提示2种化合物均具有抑制炎症发生的作用；组织学观察结果也证实2种化合物均具有抑制尿道炎症细胞生成和浸润的作用。

综上所述，该研究筛选出了具有较好抗炎活性的季铵盐单体化合物。下一步拟将2种化合物与含有不饱和双键的天然乳胶接枝，再测定乳胶的抗菌活性，最终得到具有抗菌活性的乳胶材料。该研究为开发新型抗菌材料奠定了基础。

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(2017-09-28收稿 责任编辑王 曼)

Antibacterial activityinvitroand anti-inflammatory actioninvivoof new quaternary ammonium salt monomer compounds

SHIYingying,ZHAOQi,WANGYang，RENYandan,ZHANGMengying，HOUGuiqin,LUZhaoming

DepartmentofClinicalPharmacy,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

quaternary ammonium salt monomer;antibacterial activity;anti-inflammatory action

Aim: To observe the activities of antibacterialinvitroand anti-inflammationinvivoof 4 kinds of synthesized quaternary ammonium salt monomer compounds.MethodsThe liquid preparation and solid preparation at high, medium and low concentration of the four compounds were prepared, and their antibacterial activity againstStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandSalmonellawere tested using the liquid preparations. The irritated effects were investigated on normal skin of rabbits. The common catheters smeared with the compounds were placed into the rabbit urethra for 5,10,15 d, then the plasma levels of IL-10 and TNF-α were determined by ELISA, and the production of urethritis cells were investigated by HE staining method on the 15th day. The rabbits with common catheter were the control.ResultsCompound 2 and Compound 4 had better inhibitory effects on the three kinds of urethral flora(P<0.05), while Compound 1 and Compound 3 had no obvious inhibitory effect. Compound 2 and 4 had no irritated effect on the rabbit skin. The plasma level of IL-10 of Compound 2 and 4 groups was higher, and that of TNF-α was lower than the control group(P<0.05). The result of HE stainning showed that the number of inflammatory cells and the infiltration ability in Compound 2 and 4 groups were lower than the control group.ConclusionCompound 2 and Compound 4 may have good activities of antibacterialinvitroand anti-inflammationinvivo.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.005

*河南省科技攻关计划项目 132102210564

郑州大学药学院临床药学系 郑州 450001

#通信作者，男，1966 年11月生，博士，副教授，研究方向：药理学，E-mail:lzm310@zzu.edu.cn

R965.1