粪菌移植对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的影响*

杨 璐，李庆华#，许 玲，刘雯雯，刘艳霞，黄团结，邢 衢，李 鹏，张 乐，关方霞

粪菌移植对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的影响*

杨 璐1)，李庆华1)#，许 玲1)，刘雯雯1)，刘艳霞1)，黄团结1)，邢 衢1)，李 鹏1)，张 乐1)，关方霞1,2)#

小鼠；阿尔茨海默病；粪菌移植；肠道菌群；β淀粉样蛋白

目的：观察粪菌移植(FMT)对阿尔茨海默病模型小鼠(APP+转基因小鼠)学习记忆能力及脑内β淀粉样蛋白(Aβ)沉积的影响。方法将15只小鼠分为APP-组、APP+组、FMT组，每组5只。对FMT组APP+小鼠进行FMT，每天1次，连续4周，APP+组及APP-组用生理盐水灌肠处理。4周后，通过Morris水迷宫实验观察各组小鼠认知能力和学习记忆能力；采用Western blot法检测小鼠脑组织中衰老相关蛋白(P21、P53、Sirt1、Sirt2、PCNA)的表达情况；采用刚果红染色法观察小鼠脑内Aβ沉积的变化情况。结果与APP-组相比,APP+组小鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，目标象限停留时间减少(P<0.05)。经FMT处理后，FMT组小鼠与APP+组小鼠相比，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，目标象限停留时间延长，Aβ沉积减少，脑组织中衰老相关蛋白P21、P53表达减少，而Sirt1、Sirt2、PCNA表达增多(P<0.05)。结论FMT 可以改善阿尔茨海默病小鼠的学习记忆能力，减缓衰老，减少脑组织Aβ沉积。

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的特征表现为神经衰退，患病者多为老年人[1]。脑组织内的β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)聚集以及神经原纤维的缠绕这两个特征是AD在病理学上的主要表现[2]。据报道[3]全球有3 500万老年人遭受AD的困扰，预计在未来的40 a里，将会有1亿的人口患AD。肠道菌群和宿主是共同进化的，肠道菌群和宿主之间会建立重要的共生关系。肠道菌群是和机体协同进化的微生物，它的改变会影响宿主健康，宿主菌群与宿主是互利共生的关系，被称为“超级有机体”[4]。肠道菌群的动态平衡状态被打乱时，就可能导致机体患各种疾病，如急慢性胃肠道疾病等[4]。相关研究[5]发现，肠道菌群失调很可能是导致精神分裂、抑郁症、AD和帕金森症等的重要原因，表明肠道菌群在宿主肠道与中枢神经系统的互相应答反应中发挥作用，据此提出脑-肠轴理论，即大脑可以调节肠道蠕动、消化分泌和营养物质的吸收和分布，从而使肠道菌群平衡，肠道菌群反过来可以影响神经信号的传递，从而影响人的情绪和行为。与此同时相关研究[5]还发现，由于无菌小鼠体内缺少肠道菌群，其神经系统功能会有障碍以至于其难以发育成熟。最近几年，对粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)的研究[6]越来越多。随着FMT技术的出现以及越来越多的应用，可以看出其能用来调整肠道微生物的多样性及组分，调制肠道微生物，或许可以作为一种用于调节大脑和机体行为的手段[7]。因此该研究以APP+转基因小鼠(一种AD小鼠)为模型，利用FMT对AD小鼠进行干预，观察FMT对APP+小鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1.1材料琼脂糖凝胶粉(美国Sigma公司)、100 bp DNA Marker(北京鼎国生物技术有限公司)、刚果红染料和苏木精(上海生工生物工程技术服务有限公司)、PCR扩增仪和台式4 ℃离心机(美国Thermo公司)、冰冻切片机和荧光显微镜(德国Leica公司)、多功能分子成像分析系统(美国Azuar Biosystems公司)、Morris水迷宫系统(西班牙 Panlab公司)，APP基因上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，DNA 提取试剂盒(康为世纪生物技术有限公司)，P21、P53、Sirt1、Sirt2、PCNA兔源单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，清洁级APP695V717I转基因小鼠购自中国协和医科大学动物研究所。

1.2APP+转基因模型小鼠的鉴定取0.3 cm长小鼠尾巴，用试剂盒提取全DNA，PCR扩增产物大小为284 bp的APP基因。引物序列:上游5’-CCCT GAACCTGAAACATAAAAT-3’，下游5’-GCTACGAA AATCCAACCTACAA-3’。PCR扩增条件：94 ℃ 50 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，4 ℃保存。PCR结束后10 g/L琼脂糖凝胶电泳，电压90 V，时间50 min。经PCR扩增，鉴定出10只APP+小鼠以及5只APP-小鼠。

1.3新鲜粪菌液的制备在灌肠当天收集APP-组小鼠的新鲜粪便，并用电子天平称重，将其置于密封的小烧杯中，加入生理盐水，在磁力搅拌器上搅拌，用折叠3层的纱布过滤，用离心管收集滤液，标记滤液的体积，1 200 r/min离心5 min，倒掉上清，再加入生理盐水至原体积，混匀，重复此步骤3次，下层沉淀物再用蒸馏水溶解，涡旋混合均匀即为灌肠液体，用于FMT。

1.4小鼠分组及干预处理把鉴定的10只APP+小鼠采用随机数字表法分为APP+组和FMT组，每组各5只，另外5只APP-小鼠为APP-组。根据文献[7-8]报道，采用灌肠法进行FMT，APP-组及APP+组行生理盐水灌肠，FMT组行粪便滤液灌肠(每日剂量为15.197 g/kg)。第1次灌肠前禁食不禁水24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，先在直径为2 mm导管表面涂抹甘油，使其润滑，再从肛门缓缓插进结肠，长度约4 cm，倒立慢慢注入200 μL粪菌液，轻轻拔出软导管，用医用纱布压肛门几秒，捏住小鼠尾巴，使小鼠倒立，1 min后再放回笼中。每天灌肠1次，持续4周，给予正常饮食。

1.5Morris水迷宫检测各组小鼠的学习记忆能力

FMT 4周后，各组小鼠开始水迷宫的训练，Morris水迷宫是一个半径为60 cm的水池，水迷宫有4个象限，平台的半径是4.5 cm，把平台放在第一象限，水池内的水溶解奶粉使其为乳白色，不透明，池子里的水温为19～20 ℃，水平面没过平台约1 cm。每只小鼠游泳训练时间是1 min，待其训练完后，放在平台上，记忆观察10 s，让其记忆水迷宫的空间位置，擦干后放回笼。定位航行实验：在FMT 结束后，开始每日上、下午对小鼠进行训练，每只训练4次，训练结束后第1～5天进行测试，分别从4个象限依次放入，仪器自动计算1 min内到达平台的耗时，也就是逃避潜伏期。假如60 s时未到达平台，把它引导到平台上，并强制让其停滞10 s。空间探索实验：训练第6天，拿走平台，从任意一个象限放入水中，仪器自动计算在1 min内小鼠穿越平台次数以及目标象限停留时间百分比。

1.6海马组织Aβ沉积的检测Morris水迷宫实验结束后，将小鼠麻醉，称重，心脏取血，用生理盐水灌注，取脑，固定24 h后，浸泡在质量分数为30%的蔗糖溶液中24 h后，切片，片厚8 μm，进行刚果红染色。具体步骤：质量分数为1%刚果红溶液浸染20 min(37 ℃孵育)；蒸馏水冲洗 5～10 s，质量分数为0.1%氢氧化钾溶液分化2 s；苏木精复染2 min；用体积分数为100%乙醇脱水，浸入二甲苯中10 s，指甲油封片。400倍镜下取5个视野拍照采集图片并计数阳性斑块(橘红色)的数目。

1.7小鼠脑组织中衰老相关蛋白表达的检测在Morris 水迷宫实验结束后，取出小鼠脑组织用RIPA裂解液提取全蛋白，用微量分光光度计测定浓度，加2×SDS-PAGE Loading Buffer，调整蛋白浓度为2.5×104mg/L，煮沸后-80 ℃保存。每组取100 μg总蛋白点样，SDS-PAGE跑胶2 h,并转膜2 h，封闭2 h，加一抗(Sirt1、Sirt2、PCNA、P21和P53均按11 000稀释)，置4 ℃冰箱过夜，洗膜4次，加二抗，孵育2 h，洗膜4次，每次10 min，曝光，采集图片，用Image J对图像进行灰度分析。

1.8统计学分析采用SPSS 21.0处理数据。3组小鼠干预前后体重变化、水迷宫实验结果、脑组织Aβ沉积斑块数、衰老相关蛋白相对表达量的比较采用单因素方差分析及LSD-t检验或重复测量数据的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1APP+转基因小鼠的鉴定结果见图1。

M：100 bp Marker;1～6：APP+转基因小鼠。图1 APP+转基因小鼠的鉴定结果

2.2各组小鼠干预前后体重的变化结果见表1。

表1 各组小鼠干预前后体重变化情况 g

F=107.158,P<0.001;*：两两比较，P均<0.05。

2.3各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期的比较结果见表2。APP+组与APP-组比较，逃避潜伏期延长；FMT组与APP+组比较，逃避潜伏期缩短。

表2 各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期的比较 s

F组间=33.141，F时间=665.054，F交互=6.437，P均<0.001；*：与APP-组相比，P<0.05；#：与APP+组相比，P<0.05。

2.4各组小鼠空间探索实验穿越平台次数及目标象限停留时间百分比的比较结果见图2、表3。可知，与APP-组相比，APP+组小鼠目标象限停留时间减少，穿越平台次数减少；与APP+组相比，FMT组小鼠目标象限停留时间更长，穿越平台次数增加。

A～C：分别为APP-组、APP+组和FMT组。图2 空间探索实验各组小鼠活动轨迹图

组别n目标象限停留时间百分比/%穿越平台次数APP-组568．90±1．448．30±1．30APP+组548．66±1．95∗3．30±0．70∗FMT组561．69±2．66#6．30±1．30#F72．63411．400P<0．001<0．001

*：与APP-组相比，P<0.05；#：与APP+组相比,P<0.05。

2.5各组小鼠脑组织中衰老相关蛋白表达的检测

结果见图3、表4。可以看出，APP+组小鼠脑组织中衰老相关蛋白P21、P53的表达量高于APP-组，Sirt1、Sirt2、PCNA的表达量低于APP-组；与APP+组比较，FMT组小鼠脑组织中P21、P53的表达量下降，Sirt1、Sirt2、PCNA的表达量升高。

1～3：分别为APP-组、APP+组和FMT组。图3 各组小鼠脑组织中衰老相关蛋白的表达

组别nP21P53Sirt1Sirt2PCNAAPP-组51．19±0．060．71±0．021．46±0．111．14±0．111．90±0．48APP+组51．41±0．87∗1．40±0．05∗0．74±0．13∗0．57±0．74∗0．93±0．13∗FMT组50．72±0．03#0．46±0．15#1．30±0．92#0．92±0．15#1．12±1．07#F110．63676．12644．09541．154161．011P<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

*：与APP-组相比，P<0.05；#：与APP+组相比，P<0.05。

2.6各组小鼠脑组织Aβ沉积的变化结果见图4、表5。各组小鼠脑组织中出现大小不一、染色不均的橘红色斑块，多为圆形或不规则形。FMT组斑块较APP+组变小，染色变浅；APP-组此斑块较少。

A～C：分别为APP-组、APP+组、FMT组；箭头所指为Aβ阳性斑块。图4 各组小鼠脑组织中Aβ刚果红染色结果(×400)

组别n阳性斑块数APP-组57．67±2．08APP+组5109．00±15．72∗FMT组576．33±9．61#

F=70.056,P<0.001;*：与APP-组相比，P<0.05；#：与APP+组相比，P<0.05。

3 讨论

AD是一种衰老相关的疾病，衰老的机体多伴有严重的退行性变,如肌肉萎缩、动脉粥样硬化、神经退行性变等,这些年龄相关疾病在使老年人失去生活质量的同时也给家庭和社会带来极大的负担。目前临床上主要利用胆碱酶抑制剂类药物来改善轻度痴呆，但尚无有效治疗AD的方法，所以急需寻找有效的治疗方法[9]。FMT是在受体的消化道内移植健康状况良好的供体的肠道内功能菌群，从而改变受体肠道菌群进而治疗疾病[10]。肠道菌群参与AD的机制已被初步阐述：肠道菌群紊乱导致肥胖和代谢综合征，血液和脑组织较高的胰岛素水平可产生淀粉样蛋白并形成破坏性的沉积斑，进而导致AD[11]。Aβ是老年斑的主要成分，可以被刚果红染色，Aβ沉积最终可导致神经元凋亡和认知功能障碍[12]。很多神经系统疾病和精神疾病患者的肠道微生物都存在组群的动荡，从这些现象可以看出，对神经退行性疾病进行的治疗也许可以从改变肠道微生物组成入手[13]。因此，该研究对APP+小鼠进行正常肠道菌群的移植，希望可以通过这种方法改变APP+小鼠的肠道菌群组成，进而通过肠道微生物的改变影响APP+小鼠认知功能。通过水迷宫实验检测小鼠的认知功能，发现FMT组小鼠的学习记忆能力有所提高；通过刚果红染色发现APP+组小鼠脑组织Aβ的沉积明显多于APP-组小鼠，而FMT组小鼠Aβ的沉积较APP+组明显减少；以上结果说明FMT在一定程度上减缓了AD小鼠的衰老。

综上所述，对APP+小鼠进行正常菌群的移植能改善其学习记忆功能，减少脑组织Aβ沉积，缓解衰老进程。

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(2017-03-30收稿 责任编辑姜春霞)

Effects of fecal microbiota transplantation on learning and memory ability of Alzheimer′s disease mice

YANGLu1),LIQinghua1),XULing1),LIUWenwen1),LIUYanxia1),HUANGTuanjie1),XINGQu1),LIPeng1),ZHANGLe1),GUANFangxia1,2)

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

mouse;Alzheimer′s disease;fecal microbiota transplantation;gut microbiota;amyloid β-protein

Aim: To study the effects of fecal microbiota transplantation(FMT) on learning and memory ability and amyloid β-protein(Aβ) deposition in Alzheimer′s disease mice.MethodsA total of 15 mice were randomly allocated into APP-group, APP+group, and FMT group(n=5). The APP+mice in FMT group were treated with FMT for 4 weeks, while the mice in APP+group and APP-group were enemaed with normal saline. The learning and memory ability of mice was tested by Morris water maze.And then Western blot was employed to detect the expression of senescence related proteins(P21, P53, Sirt1, Sirt2, PCNA) in mice brain tissue, and the change of Aβ deposition in the brain was observed by Congo red staining.ResultsCompared with the APP-group, the escaping latency of the APP+group was longer, while the times of crossing the platform quadrant was less and the time of spending in the target quadrant was shorter(P<0.05). After FMT, the escaping latency of the mice was decreased, the times of crossing the platform quadrant and the time of spending in the target quadrant were increased(P<0.05). And the deposition of Aβ in brain tissue of FMT group was reduced compared with the APP+group(P<0.05). Additionally, the expressions of P21 and P53 in brain tissue of FMT group reduced, and the expressions of Sirt1, Sirt2 and PCNA increased significantly(P<0.05).ConclusionFMT could improve the learning and memory ability of Alzheimer′s disease mice by slowing down its aging and reducing the formation of Aβ deposition in brain.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.010

*国家自然科学基金资助项目 81471306;河南省高校科技创新团队基金资助项目 15IRTSTHN022；河南省科技创新人才计划基金资助项目154200510008

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院干细胞研究室 郑州 450052

#通信作者：关方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干细胞与再生医学，E-mail：guanfangxia@126.com；李庆华，女，1983年6月生，博士，讲师，研究方向：微生物学，E-mail:guozilqh@126.com

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