白酒中8种生物胺的高效液相色谱分析法

王春利，赵晓娟，王英姿

（1.江门出入境检验检疫局，广东江门 529000； 2.仲恺农业工程学院，广东广州510225）

白酒中8种生物胺的高效液相色谱分析法

王春利1，赵晓娟2，王英姿1

（1.江门出入境检验检疫局，广东江门 529000； 2.仲恺农业工程学院，广东广州510225）

建立了白酒中8种生物胺残留的高效液相色谱分析方法，样品采用正丁醇-三氯甲烷萃取，丹磺酰氯衍生。实验结果表明，该方法在1～50 mg/L范围内线性关系良好，R2≥0.996；在1～10 mg/L添加水平范围内，平均加标回收率在82.22%～94.11%之间，相对标准偏差RSD＜10%；LOD在0.01～0.10 mg/L之间，LOQ在0.03～0.30 mg/L之间，该方法可用于白酒中生物胺的检测。

白酒； 生物胺； 高效液相色谱法； 含量调查

生物胺(biogenic amine，BA)是一类低分子质量的碱性多胺，具有生物活性，普遍存在于生物体的细胞中，是细胞内的正常活性成分。微量的生物胺对人体有益，可以促进人体的生长发育和新陈代谢，提高肠道系统的免疫能力[1]。但是，当人体吸收过量的生物胺后，会出现头痛、血压变化、心悸等严重后果[2]。此外，生物胺还是生成致癌物质亚硝胺的前体物质，如腐胺和尸胺，不仅能增强组胺的毒性，而且还能与亚硝酸盐反应生成亚硝基胺[3-4]，严重威胁人体健康和生命安全。

生物胺是由游离氨基酸在微生物产生的脱羧酶作用下而生成，也可以是醛被胺化作用后产生，食品在发酵或腐烂过程中会产生生物胺[5]。生物胺广泛存在于发酵乳制品[6]、酒类[7-8]、水产品[9]、肉类产品[10]、调味液[11-12]等富含蛋白质和氨基酸的食品中。用于食品中生物胺测定的方法主要有电化学法[13]、色谱法[14-17]、酶联免疫法[18]等。目前，酒中生物胺的研究多集中于葡萄酒、啤酒、桑果酒及黄酒，而白酒中生物胺检测方法、生物胺种类和含量的研究报道比较少见。本研究建立的方法简便、快捷、准确，可以用于白酒中8种生物胺的同时测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

标准溶液配制：准确称取适量色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺标准品于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，混匀，配制成浓度为1000 mg/L的标准储备液，0～4℃保存。根据需要将标准储备液稀释成相应浓度的标准溶液。

试剂及耗材：正己烷、甲醇和丙酮（均为色谱纯），德国Merk公司；乙醚、正丁醇、三氯甲烷、谷氨酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯），广州试剂厂；色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、精胺和亚精胺，美国Sigma公司；酪胺，德国Dr公司；丹磺酰氯（纯度均大于98%）、组胺（纯度＞96%），FLUKA公司。

仪器设备：HPLC Waters e2695配Waters e2489紫外检测器，美国Waters公司；3K15冷冻离心机，德国Sigma公司；VORTEX-2旋涡混合器，美国GENE公司；HH-2数显恒温水浴锅，中国晶波；Turbovap lv浓缩氮吹仪，美国caliper公司；TP-214型分析天平，美国DENVER；Orion 868酸度计，美国Orion公司；Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司；0.22 μm滤膜针头滤器，上海安谱。Thermo移液枪（200～1000 μL），美国Thermo Fisher公司。

1.2 液相色谱条件

色谱柱：Venusil XBP C18柱（250 mm ×4.6 mm，内径3 μm）；检测器波长254 nm，进样量20 μL，柱温30℃，流动相A为甲醇，B为超纯水，流速1.5 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3 样品的萃取和衍生

量取20.00 mL水样，滤纸过滤，滤液加氯化钠至饱和（若水样中含有油脂则加入10 mL正己烷，混匀，弃去上层有机相）。量取5 mL滤液于15 mL离心管中，用0.1 mol/L的氢氧化钠调节pH值到12.0，加入5.0 mL正丁醇和三氯甲烷（1∶1，V/V）混合溶液，漩涡振荡2 min后以5000 r/min离心5 min，保留上层有机相，重复上述萃取2次，合并萃取液。量取3.0 mL萃取液并加入浓度1 mol/L盐酸0.2 mL，60℃氮吹近干，用0.1 mol/L的盐酸定容至1 mL，待衍生。

精确量取1.0 mL待衍生的试样溶液后，加入1.5 mL饱和碳酸氢钠溶液和1.0 mL丹磺酰氯衍生溶液（10 mg/L丙酮溶液），充分混匀。在60℃水浴条件下反应30 min，再加入谷氨酸钠溶液100 μL，充分混匀，60℃保温15 min。取出，加入超纯水l mL，40℃氮吹除去丙酮，之后加入乙醚3 mL，漩涡振荡1 min，静置分层后，吸取乙醚层，重复操作2次，合并乙醚提取液，40℃条件下氮气吹至近干，加入1.0 mL乙腈，溶液用0.22 μm滤膜过滤，滤液待测。

2 结果与讨论

2.1 线性关系和检出限

按照1.1中的方法配制8种生物胺的混合标准溶液进行线性实验，标准质量浓度为1.0 mg/L、2.50mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、25.0mg/L、50.0 mg/L。按照1.3中的方法进行衍生，通过HPLC进行测定。以3倍信噪比作为检出限的确定标准，以10倍信噪比作为定量限的确定标准。生物胺分离的液相色谱图见图1，回归方程、相关系数及检出限见表2。

图1 5种生物胺混合标准溶液的液相色谱图 (5.0 mg/L)

由图1可知，8种生物胺色谱峰无重叠，分离较好。由表2可知，8种生物胺在1.0～50.0 mg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.996。各组分生物胺的检出限(LOD)为0.01～0.10 mg/L，定量检出限(LOQ)为0.03～0.30 mg/L，满足生物胺检测的要求。

表2 8种生物胺标准的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

2.2 重复性的测定

对8种生物胺混标进行重复测定(n=5),结果见表3。结果显示相对标准偏差RSD≤5.02%，表明重复性较好。

表3 生物胺的重复性实验 (mg/L)

2.3 加标回收率的测定

选取空白样品做1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L 3个浓度的加标回收率实验，应用上述方法进行前处理并测定，各加标水平样品平行测定3次，结果见表4。

由表4可知，5种生物胺在1.0～10.0 mg/L添加水平范围内，平均回收率在82.22%～94.11%之间，相对标准偏差RSD在2.36%～7.96%之间，均符合检测要求。

2.4 白酒样品分析

表4 生物胺加标回收率的测定

表5 白酒样品中生物胺的测定 (mg/L)

在当地超市随机购买5种酱香型白酒，按照本研究方法进行生物胺检测，检测结果见表5。

由表5可知，5种白酒中均有色胺和酪胺，β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、精胺和亚精胺均未检出。其中色胺含量在8.7～13.0 mg/L，酪胺含量在0.016～0.027 mg/L，酪胺含量明显小于色胺，色胺为5种白酒中的主要生物胺。

3 结论

目前，国内外关于酒中生物胺的研究多集中于啤酒、黄酒和红酒，对于白酒中生物胺的检测方法和生物胺分布情况研究较少。本研究所建立的方法，操作简便，灵敏度高，可用于白酒中色胺、腐胺、β-苯乙胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的快速检测，这对于提高白酒产品质量，保障食品安全，帮助政府部门加强酒类市场监管具有重要意义。此外，与欧盟、美国相比，我国在酒中生物胺限量标准制定方面存在较大差距，本文也为相关标准的制订和完善提供参考。

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Determination of 8 Biogenic Amines in Baijiu by HPLC

WANG Chunli1,ZHAO Xiaojuan2and WANG Yingzi1
(1.Jiangmen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jiangmen,Guangdong 529000;2.Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou,Guangdong 510255,China)

A method for the determination of 8 biogenic amines in Baijiu by high-performance liquid chromatography(HPLC)had been developed.Baijiu samples were extracted with N-butanol and chloroform,and derived by sulfonyl chloride.The experimental results showed that,the proposed method had a good correlation within the range of 1～50 mg/L,and the correlation coefficient was above 0.996,the average recovery was 84.75%to 95.20%in 1～10 mg/L addition level range,RSD(n=3)was less than 10%,LOD was between 0.01～0.10 mg/L,and LOQ ranged within 0.03～0.30 mg/L.This method could be used for the detection of biogenic amines in Baijiu.

Baijiu;biogenic amines;HPLC;content measurement

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）11-0113-04

10.13746/j.njkj.2017171

2016年广东省科技发展专项资金（协同创新与平台环境建设方向）项目；江门市科技项目（江科[2016]191号）。

2017-06-13

王春利 (1980-)，男，高级工程师，硕士，E-mail：344159092@qq.com。

优先数字出版时间：2017-08-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170817.1439.013.html。