臭豆腐卤水冻干前后挥发性成分的比较研究

石 聪，贺 静，蒋立文*，李 跑

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

臭豆腐卤水冻干前后挥发性成分的比较研究

石 聪1，2，贺 静1，2，蒋立文1，2*，李 跑1，2

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

为研究长沙具有地方代表性的3种臭豆腐卤水真空冷冻干燥前后挥发性成分的差异，在发酵成熟的卤水中加入一定数量保护剂后进行真空冷冻干燥，检测臭豆腐卤水冻干前后微生物总数的变化并利用固相微萃取（SPME）结合气-质联用（GC-MS）技术对3种臭豆腐卤水及其冻干粉复水后挥发性成分进行分析。结果表明，3种卤水冻干前后挥发性成分分别为43、47，49、53，31、40种，均集中了大量挥发性成分的主要组分，3种冻干粉复水后能快速启动发酵，培养12 h基本达到南方臭豆腐卤水的发酵效果，为卤水标准化生产提供了可能。

臭豆腐；卤水；冻干粉；挥发性成分

臭豆腐是我国南方备受人们喜爱的地方特色小吃之一，具有浓郁的地域特色。它是将白豆腐通过卤水浸泡着色油炸后直接蘸食。因此臭豆腐卤水的制作是南方臭豆腐风味形成的关键工艺。制作卤水的原料一般包括苋菜梗、竹笋、豆豉、香菇等植物性原料，需要在自然条件下经过长时间堆积自然发酵后才能形成具有特殊“臭味”，这个过程是微生物、原料内源酶等多重因子作用的结果[1-3]。因此卤水制作是一个复杂的发酵过程，一般难以复制，不便于工业化标准化。

近年来，对臭豆腐中挥发性风味物质的研究越来越多，亓顺平等[4-7]就臭豆腐卤水研究了其挥发性风味成分，基本上确定了臭豆腐中具有“臭”味的主要挥发性物质为苯酚、吲哚之类的物质。卤水为液态物质，借鉴乳酸菌直投式发酵剂（direct vat set，DVS）大规模产业化的生产技术和原理，考虑将含有大量活菌的卤水进行浓缩探讨制作发酵剂的可能性。将其采用真空冷冻干燥方法制作冻干粉，有利于卤水更好的贮存、运输与销售，加快臭豆腐产业的发展。目前对臭豆腐卤水制成冻干粉及其前后风味差异的研究较为鲜见。

本试验采用真空冷冻干燥的方法将几种卤水制成冻干粉，再使用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）结合气质联用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）法测定卤水制成冻干粉复水后的挥发性成分[8]，探究臭豆腐卤水冻干前后微生物总数的变化、卤水制成冻干粉复水后挥发性成分的变化趋势及核心气味物质的变化，以期为臭豆腐工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1#臭豆腐卤水：来源于企业用于生产的老卤水；2#臭豆腐卤水、3#臭豆腐卤水：湖南农业大学食品科技学院微生物实验室自制；脱脂乳粉：河南明瑞食品添加剂有限公司；麦芽糊精、谷氨酸钠、甘油（均为食品级）：德国三颗星食品物料公司。豆腐黄浆水：购于湖南农业大学滨湖农贸市场。

1.2 仪器与设备

PL4002分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；GC-MS-QP2010气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；固相微萃取（SPME）装置：美国Supelco公司；TALBOYS磁力搅拌器：天津赛力斯自动化科技有限公司；DW-HL828超低温冷冻储存箱：中科美菱低温科技有限责任公司；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；SCIENTZ-18N冷冻干燥箱：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 卤水的来源及制作

卤水1#：来源于生产企业的老卤水；

卤水2#：原料为香菇1.3 kg、浏阳豆豉0.45 kg、豆腐0.2 kg、豆腐黄浆水0.45 kg、春笋0.3 kg、青菜0.5 kg、凉开水2 kg，另加入0.52 kg卤水1#，按配比洗净、沥干、切碎、煮透和冷却后放入缸中，室温条件下自然发酵11个月；

卤水3#：除不加入卤水1#，其他配方与卤水2#一致，室温条件下自然发酵11个月。

1.3.2 卤水冻干粉制作的工艺流程

卤水的预处理：取发酵成熟的卤水上清液100 g→加入稳定保护剂：脱脂奶粉（10 g）、麦芽糊精（10 g）、谷氨酸钠（10 g）、甘油（3 g）[9-10]→分装：倾注到平皿3/4，保鲜膜封口，用注射器扎数个孔→预冷冻处理：-80℃急速冷冻3～4 h→真空冷冻干燥：冷冻干燥（-40 ℃）36 h，得到样品，3个样品标号为冻干1#、冻干2#、冻干3#

1.3.3 方法

（1）挥发性成分的检测

固相微萃取：取2mL卤水或用黄浆水复水后的冻干粉样品，加入10 mL的顶空进样瓶中，盖上密封垫和铝帽，密封后于磁力搅拌器上，60℃加热的条件下平衡20 min，然后通过隔垫插入已活化好的SPME萃取头，推出纤维头，纤维头距样品液面约10 mm，顶空吸附30 min后，插入气相色谱进样口解吸，时间为5 min。

萃取头的老化：萃取头在使用前，必须进行老化。将85 μm（PA SPME）萃取头于280 ℃老化0.5 h，直至无干扰峰出现。

气相色谱条件：DB-5MS色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm）；载气：氦气（He）；柱流速：1 mL/min；进样口温度：240℃；进样方式：不分流进样；升温程序：起始温度50℃，保留2min；然后以5℃/min的速度升温至200℃，保留14min；再以15℃/min的速度升温至240℃，无保留。

质谱条件：离子源温度为200℃，电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源，灯丝电流为150 μA，电子能量为70 eV，扫描质量范围为45～500 m/z。

定性定量分析：总离子流色谱图经美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2014S标准谱库检索定性鉴定出挥发性成分，采用面积归一法进行定量分析，得到各成分在臭豆腐卤水挥发性风味物质中的相对含量

（2）冻干前后微生物总数的比较

采用国标GB 4789.2—2010《菌落总数测定》中的方法测定3种卤水冻干前后微生物总数的变化，3个重复。

（3）冻干后复水发酵试验

将冻干后获得的卤水粉剂10 g加入1 000 mL豆腐黄浆水中进行发酵，控制温度30℃，时间12 h，然后按照臭豆腐制作流程浸泡豆腐并油炸试味，比较前后的差异性。

2 结果与分析

2.1 冻干前后微生物总数的比较

卤水样品冻干前后细菌总数的变化结果见表1。

表1 冻干前后微生物总数的变化Table 1 Change of total microbial before and after lyophilization

由表1可知，3种卤水冻干前后微生物数均在1012个/mL（g）以上，冻干后微生物数量有所减少，这可能是因为部分微生物在冻干过程中受环境影响而死亡，但冻干过程对卤水中微生物数量影响不大，基本满足南方臭豆腐生产要求。

2.2 三种臭豆腐卤水及冻干粉的挥发性成分GC-MS分析

卤水1#、卤水2#、卤水3#及制成冻干粉复水挥发性成分的GC-MS分析总离子流色谱图结果见图1。

图1 三种卤水及其冻干粉挥发性成分的GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in three kinds of the ripening brine and lyophilized powder analysis by GC-MS

对GC-MS分析检测的成分进行谱库检索和其他方法核对及确认，3种卤水及制成冻干粉中挥发性成分鉴定结果见表2。

表2 3种臭豆腐卤水及其冻干粉中挥发性物质的相对含量Table 2 Relative contents of volatile components in three kinds of ripening brine and lyophilized powder

2.3 气味物质组分分类分析

3种卤水及其冻干粉复水后各大类物质相对含量的比较结果见图2，3种卤水及其冻干粉中相同物质含量的比较结果见图3。

图2 3种卤水及其冻干粉复水后各大类物质相对含量的比较Fig.2 Comparison of relative contents of volatile components in three kinds of ripening brine and lyophilized powder after rehydration

图3 3种卤水及其冻干粉中相同物质相对含量的比较Fig.3 Comparison of the relative contents of the same substances in the three kinds of ripening brine and lyophilized powders

2.3.1 酚类

酚类化合物都具有特殊的芳香气味，易被氧化。由图2可知，本研究检测到3种卤水和相应的冻干粉挥发性成分中酚类物质种类分别为7、5、3、3、5、4种。但含量均较高，分别为36.27%、28.78%、18.91%、27.34%、31.97%、79.38%。由图3可知，苯酚和4-甲基苯酚是3种卤水和冻干粉复水后均存在的物质，且4-甲基苯酚含量较高，分别达到25.06%、24.94%、16.79%、26.94%、28.09%、78.64%，4-甲基苯酚具有窖泥臭[11]，被认为是卤水的主体物质。对比冻干粉制作前后，卤水1#在制成冻干粉后酚类物质略微下降，但差异不大，卤水2#和冻干3#中酚类物质含量均明显高于卤水中酚类物质。卤水3#冻干粉中4-甲基苯酚含量较高，这可能是冻干过程集中了大部分的卤水中的物质，且在冻干过程其他物质转化成了该物质所致。酚类化合物对臭豆腐香气起增强作用，对产品的稳定性起到一定作用[12]。表明冻干过程对臭豆腐品质有积极作用。

2.3.2 吲哚类

由图2、图3可知，本研究检测到吲哚、3-甲基吲哚是卤水和冻干粉复水后均存在的物质，且含量较高，3种卤水和相应的冻干粉中3-甲基吲哚含量分别为47.06%、32.04%、0.17%、0.05%，28.54%、13.62%，3-甲基吲哚有腐烂的、令人作呕的臭气、卫生球以及大粪臭，但极度稀释后有成熟的水果的香味[13-14]，对臭豆腐的臭香味起到重要作用，3-甲基吲哚在卤水和冻干粉中含量相差不大，在卤水2#中含量较低，这可能与卤水2#发酵程度有关，卤水2#在自然发酵11个月的条件下可能没有发酵完全，因此含量较低。且3-甲基吲哚被认为是臭豆腐卤水的核心物质之一[15]，研究表明卤水在制成冻干粉前后吲哚类物质含量相差不大。

2.3.3 酸类

由图2、图3可知，3种卤水含酸类物质的种类较为丰富，占总含量的2.20%～51.18%。乙酸和丙酸是3种卤水和冻干粉复水后均检测到的物质，丙酸是由糖类发酵而来，结合文献报道苋菜在发酵过程中含酸类物质较多[16]，发酵酸笋中乙酸含量较高[17]。由表2可知，在制成冻干粉复水后酸类物质的变化比较显著，卤水1#在制成冻干粉后酸类物质的总量是增加的，卤水2#和3#在制成冻干粉后含量下降，冻干过程对酸类物质影响较大。研究表明，酸类物质虽然在气味上带来不愉快的气味，但对臭豆腐的气味不会产生消极的影响[15]，因此冻干过程虽然对酸类物质有一定影响，但不会对臭豆腐风味造成不利影响。

2.3.4 醇类

由表2可知，3种卤水冻干粉复水后的挥发性成分中醇类物质分别占总量的1.00%、9.42%、23.53%、30.62%、0.34%、3.69%。研究表明，卤水的醇类物质的含量与发酵程度有关，发酵初期的醇类物质比较少，发酵程度越高，醇类物质含量更高[18]。原料中浏阳豆豉和香菇中酯类物质的含量较高[19-20]。卤水中醇类物质主要来源于原料发酵，并最终构成成品卤水挥发组分中的主体物质，三种卤水冻干粉中醇类物质含量明显高于卤水中的醇类物质，卤水在制成冻干粉后酯类物质呈上升趋势，冻干粉对臭豆腐的风味具有促进作用。

2.3.5 其他类

本研究检测到3种卤水和冻干粉复水后挥发性成分中酯类物质含量在0.16%～3.50%。卤水的制作原料中浏阳豆豉含酯类比较丰富，卤水中酯类物质在发酵初期数量较多，但总量较少，对比3种卤水和冻干粉酯类物质占总量的含量，无显著性差异。由图2、图3可知，冻干过程对卤水中酯类物质影响不大，3种卤水和相应的冻干粉挥发性成分中酮类物质含量在0.43%～2.87%，结合文献报道，卤水的制作原料浏阳豆豉不含有酮类物质[18]，香菇和苋菜在发酵过程中会产生较多的酮类物质[16，20]，因此这3种卤水含酮类物质较少可能与卤水的发酵程度和原料的种类有关，且卤水在制成冻干粉后其含量变化不显著。3种卤水及其冻干粉复水后的挥发性成分含硫醚类物质0.06%～0.56%，硫醚类化合物香气阈值极低，一般表现为令人不愉快的气味[17，19]，气味持久难消，因此冻干粉中硫醚类化合物含量的降低对于臭豆腐的香气成分具有促进作用。卤水1#冻干粉和卤水3#中检出醛类物质为0.02%、0.10%，其他样品中均未检出。这与卤水制作的原料有很大关系，通过对比相关原料可知，浏阳豆豉和香菇中含醛类物质均较少[19-20]。卤水在制成冻干粉前后在含醛类物质上差异不大。仅卤水1号含烷烃类物质，占总含量的1.55%，其他卤水和冻干粉中均不含烷烃类物质，这可能与发酵时间的长短有很大关系，卤水在发酵初期含烷烃类物质较少，在发酵两年以上才会含有比较多的烷烃类物质[18]。冻干粉的制作对于卤水中烷烃类物质影响不大。

2.4 快速发酵后的前后比较

3种卤水冻干粉采用豆腐黄浆水于30℃复水发酵12 h后，浸泡臭豆腐并油炸，参照商业标准SB/T 10527—2009《臭豆腐（臭干）》中臭豆腐的试味要求，样品具有臭豆腐应有的风味，样品前后差别不大，基本达到南方臭豆腐卤水的发酵效果。

3 结论

本试验采用GC-MS法对臭豆腐卤水及冻干粉复水后进行萃取，3种卤水冻干前后挥发性成分总数分别为：43、47；49、53；31、40。冻干前后相同的挥发性组分相对含量分别为84%、72%；96%、96%；70%、95%。3种卤水和冻干粉中共同存在挥发性物质有6种，相对含量在32%～95%。对比卤水冻干前后挥发性成分数量差异不大。

3种卤水和冻干复水后的主体挥发性成分差异不大，冻干后均集中了大量挥发性成分的主要组分，对卤水气味的核心物质影响不大，卤水冻干粉时宜选择合适的卤水原料配方以及发酵比较成熟的卤水进行制作，使臭豆腐卤水更具风味，以加速臭豆腐工业化的应用。

快速发酵证明方法具有一定的可行性，下一步的研究应该将臭豆腐卤水制作中关键微生物如乳酸菌、酵母菌，采用多菌种混合发酵方法进行制备，优化冻干保护剂，然后制取冻干粉，为可能的规范化标准化安全化奠定基础。

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Comparative study on the volatile components in the ripening brine for fermented stinky tofu before and after lyophilization

SHI Cong1,2,HE Jing1,2,JIANG Liwen1,2*,LI Pao1,2
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

In order to study the difference of volatile components in three kinds of the ripening brines for fermented stinky tofu before and after vacuum freeze-drying in Changsha,the ripening brines were vacuum-freeze dried with addition of a certain amount of protective agent.Microbial changes were detected in the brines before and after lyophilization.The volatile components of three kinds of the ripening brines and the freeze-dried powder were analyzed with SPME and GC-MS.The results showed that the volatile components before and after lyophilization were 43,47;49,53;31,40 species,respectively.All of them were concentrated in the main components of volatile components.The fermentation can start rapidly with addition of rehydrated lyophilized powder,and the fermentation performance basically met the requirement for the ripening brine with cultivation 12 h,which provided a possibility for standardized production.

fermented stinky tofu;brine;lyophilized powder;volatile components

TS214.2

0254-5071（2017）10-0154-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.032

2017-06-27

国家自然科学基金项目（31571819）

石 聪（1994-），女，硕士研究生，研究方向为食品工程。

*通讯作者：蒋立文（1968-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。