盾叶薯蓣皂苷水解酶发酵条件优化研究

田林双，赵玉婷，戴传超*

（1.南京师范大学 生命科学学院 江苏省微生物与功能基因组学重点实验室 江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心，江苏 南京 210023；2.江苏财经职业技术学院 粮食工程与食品药品学院，江苏 淮安 223003）

盾叶薯蓣皂苷水解酶发酵条件优化研究

田林双1，2，赵玉婷1，戴传超1*

（1.南京师范大学 生命科学学院 江苏省微生物与功能基因组学重点实验室 江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心，江苏 南京 210023；2.江苏财经职业技术学院 粮食工程与食品药品学院，江苏 淮安 223003）

从盾叶薯蓣根茎清洗液中，筛选出一株产薯蓣皂苷水解酶菌株Aspergillussp.，对该菌株产酶发酵条件进行优化研究。单因素试验结果表明，0.3%葡萄糖为碳源、0.4%蛋白胨为氮源，薯蓣皂苷水解酶活力为0.78 U/mL。正交试验结果表明，蛋白胨含量对酶活力的影响较大，产酶发酵培养基最佳配方为0.5%葡萄糖，0.6%蛋白胨，0.2%薯蓣皂苷，0.1%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4·7H2O。在此最佳培养基配方条件下，薯蓣皂苷水解酶活力为0.96 U/mL。0.2%麦冬、0.2%绞股蓝、0.2%薯蓣三种混合皂苷作为诱导物时，薯蓣皂苷水解酶活力最高，达1.26 U/mL。

盾叶薯蓣；薯蓣皂苷水解酶；发酵条件优化

盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis）又名黄姜、火头根，是一种常用的中药材，为我国特有种[1]。盾叶薯蓣根茎中主要药物活性成分为薯蓣皂苷元，含量达1.1%～16.5%，是所有薯蓣属植物中皂苷元含量最高的种[2]。

薯蓣皂苷元是目前医药化工合成多种甾体激素和甾体避孕药主要前体物质[3]，有“激素之母”之称[1，4]。甾体激素具有很强的抗炎、抗过敏、抗病毒、抗休克、抗肿瘤等多种药理作用，临床上作为治疗风湿病、心血管病、淋巴白血病、细胞性脑炎、皮肤病、恶性肿瘤和抢救危重病人的重要用药[5-7]。

盾叶薯蓣根茎中薯蓣皂苷元主要以游离型皂苷元和结合型糖苷两种形式存在。结合型糖苷由薯蓣皂苷元（甾体母核）和小分子糖通过糖苷键结合[7]。为了获得皂苷元，需要打破结合型糖苷中的糖苷键，工业上常用的方法是酸水解法，但该法使用大量酸[8-9]，且淀粉和纤维素等物质未有效综合利用，导致环境的污染和资源的浪费[1，10]。

微生物可以转化薯蓣皂苷生成皂苷元。CHENGY等[11]利用里氏木霉（Trichoderma reesei）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）固体发酵薯蓣粉，提高了薯蓣皂苷元产量。LINL等[12]用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）生物转化薯蓣皂苷。微生物转化薯蓣皂苷生成皂苷元的关键因素是其可以特异性分泌薯蓣皂苷水解酶，该酶水解皂苷，生成次皂苷或皂苷元[13]。与酸水解法获得皂苷元相比，皂苷水解酶法具有高效、环境友好等优点，受到广泛的关注，是薯蓣皂苷元制备研究的发展方向。目前，国内外研究者从多种微生物中分离出薯蓣皂苷水解酶，并对其酶学性质进行研究[14-17]，但关于薯蓣皂苷水解酶发酵生产，鲜有文献报道。本实验室前期筛选一株曲霉Aspergillussp.，分泌薯蓣皂苷水解酶，可以将薯蓣皂苷上糖基分步水解，得到次级次皂苷，并最终产生薯蓣皂苷元。本研究采用单因素及正交试验对该菌株产酶发酵条件进行优化，以期为该菌株皂苷水解酶高效发酵生产提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

曲霉（Aspergillussp.）：筛选自盾叶薯蓣根茎清洗液，产薯蓣皂苷水解酶[17]，保藏于南京师范大学微生物与生物技术研究所。

1.1.2 化学试剂

NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylicacid，DNS）（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；水溶性薯蓣总皂苷：按照文献[17]的方法，提取自盾叶薯蓣根茎；薯蓣皂苷元标准品（纯度＞99.0%）：江苏省中科院植物研究所制备。

1.1.3 培养基

保藏斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基：去皮马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH。

种子培养基：NaNO32 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，葡萄糖3 g/L，水溶性薯蓣总皂苷2 g/L，自然pH。

产酶基础培养基：葡萄糖3 g/L，NaNO32 g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KCl0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，水溶性薯蓣总皂苷2 g/L，自然pH。

培养基灭菌条件：121℃高压蒸气灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

HVE-50高压灭菌器：日本HIRAYAMA公司；CA-1390-1垂直层流洁净工作台：上海上净净化设备有限公司；GNP-9160型隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；HZQ-311C振荡器：上海一恒科学仪器有限公司；2802S UV/VIS型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；DGF30/7-IA型电热鼓风干燥箱：南京实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 发酵种子液制备

取一环活化曲霉Aspergillussp.斜面，接入种子培养基（装液量100 mL/250 mL锥形瓶），28℃、140 r/min摇瓶培养3 d，作为发酵种子液。

1.3.2 培养基配方优化单因素试验

准确量取5mL种子液，加入产酶基础培养基，装液量为50mL/150 mL，28℃、140 r/min培养6 d。分别考察碳源种类（葡萄糖、淀粉、纤维素钠、鼠李糖、蔗糖）、葡萄糖添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、氮源种类（硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵、尿素、蛋白胨、豆粕）、蛋白胨添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、薯蓣皂苷添加量（0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%）对酶活力影响。

1.3.3 培养基配方优化正交试验

在单因素试验基础上，以薯蓣皂苷水解酶活力为评价指标，设计L9（33）正交试验，因素与水平见表1。

表1 培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization

1.3.4 薯蓣皂苷水解酶活力测定方法

液体发酵培养基经滤纸过滤，获得粗酶液，以薯蓣皂苷为底物，DNS法测定酶水解产物还原糖的量，间接定量酶活力。酶活力测定方法参见文献[10]。

薯蓣皂苷水解酶活定义：每小时水解薯蓣皂苷产生1 mg还原糖的酶量，定义为一个酶活力单位（U）。

1.3.5 生物量的测定

取一定体积的培养液，用已烘至恒质量的定量滤纸过滤，菌体和滤纸一同置于干燥箱中，105℃条件下烘干至恒质量，总质量与滤纸质量之差为菌体干质量，计算单位体积培养液的菌体干质量。

1.3.6 数据处理

所有试验设计3个重复，实验数据采用SPSS 17.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 曲霉种子生长曲线

图1 曲霉种子生长曲线Fig.1 Growth curve ofAspergillussp.seed

由图1可知，在0～1 d，曲霉（Aspergillussp.）菌株处于生长延滞期，在1～3 d，曲霉生物量快速增加，处于对数生长期，在3～5 d，曲霉菌株处于生长稳定期，5 d以后，曲霉菌株开始进入衰老期。因此，选用培养3 d的曲霉种子液进行接种发酵。

2.2 碳源对水解酶活力影响

碳源是构成微生物细胞结构和代谢物中碳架的重要物质，也是微生物生长的能量来源。本研究以0.2%NaNO3为氮源，考察添加量均为0.3%的葡萄糖（CK）、淀粉、纤维素钠、鼠李糖、蔗糖对水解酶酶活的影响，结果见图2。

图2 不同碳源对水解酶酶活影响Fig.2 Effects of different carbon sources on hydrolase activity

由图2可知，葡萄糖、纤维素钠和鼠李糖作为碳源时，有利于曲霉（Aspergillussp.）菌株分泌薯蓣皂苷水解酶，水解酶活力分别为0.517 U/mL、0.500 U/mL和0.483 U/mL。淀粉作为碳源时，不利于该菌株分泌薯蓣皂苷水解酶，水解酶活力为0.181 U/mL。因此，选择葡萄糖作为产酶培养基最适碳源。

2.3 葡萄糖添加量对水解酶活力影响

以0.2%NaNO3为氮源，考察葡萄糖添加量分别为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%时对水解酶酶活的影响，结果见图3。

图3 葡萄糖添加量对水解酶酶活的影响Fig.3 Effects of glucose addition on hydrolase activity

由图3可知，以0.5%葡萄糖为碳源时，薯蓣皂苷水解酶活力最高，达0.617 U/mL。当葡萄糖添加量＞0.5%时，酶活力随着葡萄糖添加量的增大而呈现降低的趋势，高浓度葡萄糖抑制该菌株分泌薯蓣皂苷水解酶。因此，选择葡萄糖添加量为0.5%。

2.4 氮源种类对水解酶活力影响

固定0.5%葡萄糖为碳源，选用6种常见无机氮源（硝酸铵、硝酸钠（CK）、硫酸铵）和有机氮源（尿素、蛋白胨、豆粕）进行产酶试验，氮源添加量均为0.2%，不同氮源对水解酶酶活的影响，结果见图4。

图4 不同氮源对水解酶酶活影响Fig.4 Effects of different nitrogenous sources on hydrolase activity

由图4可知，以硝酸铵为氮源时，有利于该菌株分泌薯蓣皂苷水解酶，酶活为0.612 U/mL。以蛋白胨为氮源时，酶活力最高，达0.651 U/mL。硫酸铵作为氮源，该菌株产薯蓣皂苷水解酶活力最低，为0.216 U/mL。以硝酸钠、尿素、豆粕作为氮源，酶活力均较低。因此，选择蛋白胨作为产酶培养基最适氮源。

2.5 蛋白胨添加量对水解酶活力影响

以0.5%葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，考察蛋白胨添加量分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%时对水解酶酶活的影响，结果见图5。

图5 蛋白胨添加量对水解酶酶活的影响Fig.5 Effects of peptone addition on hydrolase activity

由图5可知，以0.4%蛋白胨为氮源时，薯蓣皂苷水解酶活力最高，达0.782 U/mL。当蛋白胨添加量＞0.4%时，酶活力随着蛋白胨添加量的增大而呈现降低的趋势，可能的原因是该菌株分泌薯蓣皂苷水解酶需要高C/N培养条件，增加蛋白胨添加量，降低了C/N，薯蓣皂苷水解酶活力随之降低。因此，选择蛋白胨添加量为0.4%。

2.6 薯蓣皂苷添加量对水解酶活力影响

以0.5%葡萄糖为碳源，0.4%蛋白胨为氮源，考察薯蓣皂苷添加量分别为0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%时对水解酶酶活的影响，结果见图6。

图6 薯蓣皂苷添加量对酶活影响Fig.6 Effects of saponin addition on hydrolase activity

由图6可知，薯蓣皂苷添加量从0.05%升高至0.1%，薯蓣皂苷水解酶活力有较大幅度提高，从0.623 U/mL提高至0.785 U/mL，当薯蓣皂苷添加量＞0.2%时，皂苷添加量对酶活力影响较小。可能的原因是当薯蓣皂苷添加量较低时，诱导该菌株表达薯蓣皂苷水解酶，当薯蓣皂苷添加量为0.2%时，该菌株表达薯蓣皂苷水解酶达到峰值，当薯蓣皂苷添加量＞0.2%时，并不能诱导该菌株表达更多薯蓣皂苷水解酶。因此，选择薯蓣皂苷添加量为0.2%。

2.7 正交试验与方差分析

在单因素试验基础上，以薯蓣皂苷水解酶活力为评价指标，设计L9（33）正交试验，结果与分析见表2，正交试验结果方差分析见表3。

表2 培养基配方优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

由表2可知，影响薯蓣皂苷水解酶活力的主次顺序为B＞C＞A，即蛋白胨添加量对酶活影响最大，其次是皂苷添加量，影响最小为葡萄糖添加量。最佳组合为A2B3C2，即0.5%葡萄糖，0.6%蛋白胨，0.2%皂苷。验证试验结果表明，最佳组合条件下，酶活力为0.960 U/mL。由表3可知，蛋白胨、皂苷和葡萄糖添加量对结果影响均不显著（P＞0.05）。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.8 薯蓣皂苷水解酶诱导发酵

为了研究曲霉Aspergillussp.产皂苷水解酶是组成型酶还是诱导型酶，在正交试验最佳配方条件下，分别以0.2%麦冬皂苷、0.2%薯蓣皂苷、0.2%绞股蓝皂苷及其组合为该菌株产酶诱导物，考察上述诱导物对水解酶活力的影响，结果见图7。

图7 不同诱导物对酶活影响Fig.7 Effects of different inducers on hydrolase activity

由图7可知，无诱导物时，皂苷水解酶活力为0，生物量也最低，说明该菌株产皂苷水解酶需要底物皂苷或皂苷类似物诱导才能产生，属于诱导型酶。0.2%麦冬、0.2%绞股蓝、0.2%薯蓣三种混合皂苷作为诱导物时，皂苷水解酶酶活力高达1.26U/mL，此条件下，生物量也最大，说明皂苷既可以作为皂苷水解酶诱导物，又可以作为菌株Aspergillussp.的碳源。

3 结论

曲霉Aspergillussp.产薯蓣皂苷水解酶最佳配方为0.5%葡萄糖，0.6%蛋白胨，0.2%薯蓣皂苷，0.1%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4·7H2O，此条件下薯蓣皂苷水解酶活力为0.96 U/mL。

曲霉Aspergillussp.产皂苷水解酶需要皂苷或皂苷类似物诱导才能产生，属于诱导型酶，皂苷兼作为碳源，被菌株利用。麦冬、绞股蓝、薯蓣3种混合皂苷作为诱导物时，薯蓣皂苷水解酶活力为1.26 U/mL。

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Optimization of fermentation conditions forDioscorea zingiberensisdioscin hydrolase production

TIAN Linshuang1,2,ZHAO Yuting1,DAI Chuanchao1*
(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Industrialization of Microbial Resources,Nanjing 210023,China;2.Department of Food&Pharmaceutical,Jiangsu Polytechnic of Finance&Economics,Huaian 223003,China)

Aspergillussp.with dioscin hydrolase activity was isolated from the rhizosphere ofDioscorea zingiberensis.The optimization of fermentation conditions for the dioscin hydrolase production byAspergillussp.was studied in this paper.Single factor experiments results showed that dioscin hydrolase activity was 0.78 U/ml with glucose 0.3%as carbon source and peptone 0.4%as nitrogen source.The orthogonal experiments results showed that peptone concentration was the primary factor affecting dioscin hydrolase activity.The optimum formula of fermentation medium was glucose 0.5%,peptone 0.6%,dioscin 0.2%,K2HPO40.1% ，MgSO4·7H2O 0.05%,KCl 0.05%,FeSO4·7H2O 0.001%.The strain producing dioscin hydrolase was greatly induced by the mixed dioscin,and the activity reaching 1.26 U/ml.

Dioscorea zingiberensis;dioscin hydrolase;fermentation conditions optimization

Q939.97

0254-5071（2017）10-0092-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.020

2017-07-25

南京市科委开放实验室建设项目（201302015）

田林双（1982-），男，讲师，博士研究生，研究方向为食品微生物。

*通讯作者：戴传超（1970-），男，教授，博士，研究方向为微生物。