超声波辅助复合酶法提取松茸多糖的工艺研究

陈 艳，姚 密，李美凤，孟 晓，冉 旭

(1.成都中医药大学 公共卫生学院，四川 成都 611137；2.四川大学 食品科学与工程系，四川 成都 610065）

超声波辅助复合酶法提取松茸多糖的工艺研究

陈 艳1，姚 密1，李美凤1，孟 晓1，冉 旭2

(1.成都中医药大学 公共卫生学院，四川 成都 611137；2.四川大学 食品科学与工程系，四川 成都 610065）

以松茸多糖得率为评价指标，采用单因素试验和正交试验，确定最佳提取工艺参数。结果表明，超声波提取优化工艺条件为超声温度90℃，料液比1∶15（g∶mL），超声时间10 min。在此最佳超声提取条件下松茸多糖得率为11.18%。在超声波优化结果的基础上，进行复合酶处理，最佳酶解工艺参数为酶解温度50℃，酶解时间60 min，复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶为1∶1∶1）添加量4.0%，酶解pH值6.0，此优化条件下松茸多糖得率为19.56%。复合酶超声辅助法比超声波法提取松茸多糖提高了8.38%。结果表明，复合酶超声辅助提取法提取松茸多糖是一种科学有效的方法，可显著提高松茸多糖得率。

松茸；多糖；超声波；复合酶；提取工艺

松茸（Tricholoma matsutake）是世界上珍稀名贵的天然药用菌，被誉为“菌中之王”，与灵芝、冬虫夏草、羊肚菌等珍贵食用菌相比，松茸位列首位[1]。研究表明，松茸含有松茸多糖、松茸多肽和松茸醇这三种珍稀活性物质。此外，还含有蛋白质、维生素、脂类、挥发类以及多种活性酶和丰富的膳食纤维[2-5]。其中，松茸多糖具有抗肿瘤、治疗糖尿病、保护肝脏、美白皮肤、抗氧化、抑菌抗炎以及调适压力等作用[6-9]，具有很高的研究价值。

目前关于松茸多糖的提取方法较为单一，主要采用热水浸提法，酸碱盐提取法和乙醇提取法，不仅提取率低，而且高温和过酸过碱的环境易破坏多糖结构，使其生物活性降低，需进一步改进。综合考虑提取工艺条件、多糖的活性、结构的完整性以及提取效率，采用微波、超声波辅助提取或酶工程技术前景较为广阔[10]。超声波辅助提取是利用超声波的空化效应及机械剪切对原料的破碎作用，使溶于水的胞内多糖溶出，达到提高多糖得率的目的[11-13]；酶可以分解植物细胞表面结构及胞间连丝，从而促进胞内有效成分的溶出[14-16]。因此本研究采用超声波辅助复合酶法提取松茸多糖，并采用单因素及正交试验优化提取工艺条件，从而提高多糖得率，以期为进一步开发利用这一药食两用真菌资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

松茸（干制）：四川雅江；无水葡萄糖、苯酚、硫酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、正丁醇、三氯甲烷、体积分数为95%乙醇（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；纤维素酶（20 000 U/g）、果胶酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：南京奥多福尼生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA224S电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；XL-10B密封型摇摆式粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；SB-5200DTDN超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；SHZ-DШ循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；RE52-99旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；HYC-310医用冷藏箱：青岛海尔特种电器有限公司；SFTDL-6A台式低速离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；L2S可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；GZXGF101-2-BS-II/H电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；PHS-3C酸度计：成都世纪方舟科技有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器：常州澳华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 松茸多糖提取工艺流程

1.3.2 操作要点

将干松茸用粉碎机粉碎后过80目筛，备用。称取1.000g松茸粉，按料液比加入蒸馏水，进行超声提取；超声后加入缓冲液用酸度计调节pH值，按1∶1∶1的比例加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，水浴恒温提取60 min后，90℃灭酶10 min；真空抽滤机抽滤后取滤液，用旋转蒸发器浓缩至30～50 mL，向浓缩液中加入3倍体积分数为95%的乙醇，4℃条件下醇沉过夜；5 000 r/min离心10 min后收集沉淀，加蒸馏水复溶，即为粗多糖溶液[17-19]。

1.3.3 松茸多糖含量的测定

（1）葡萄糖标准曲线的绘制

分别吸取0.1mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置于25 mL比色管中，各加蒸馏水至1.0mL摇匀，分别加入5%苯酚溶液1.0mL，再迅速加入5.0mL硫酸摇匀，放置10 min后充分混合，置于30℃水浴20 min取出后迅速冷却至室温，以蒸馏水作为空白，在波长490 nm处测定吸光度值。以吸光度值（y）为纵坐标，葡萄糖标准溶液质量浓度（x）为横坐标，制定葡萄糖标准曲线[20]。

（2）松茸多糖得率计算

将松茸粗多糖溶液用蒸馏水定容至100 mL，取1 mL稀释100倍，取稀释液1.0 mL于25 mL具塞比色管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入5.0 mL硫酸，混合均匀，放置10 min，置于30℃水浴20 min，取出后迅速冷却至室温。以蒸馏水作为空白，于波长490 nm处测定其吸光度值。根据葡萄糖标准曲线回归方程计算葡萄糖的质量，计算样品中多糖含量。多糖得率的计算公式如下：

式中：ω为样品中多糖得率，%；m1为从标曲上查得样品测定

液中多糖含量，μg；ν1为样品定容体积，mL；m2为比色测定时所移取样品测定液的体积，mL；ν2为样品质量，g；0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.3.4 单因素试验设计

（1）超声波提取条件优化试验

准确称量5份质量为1.000g的松茸粉，在超声功率200W，料液比分别为1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45（g∶mL），超声温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，超声时间分别为5 min、10min、15min、20min、25min的条件下提取多糖，以多糖得率为评价指标，考察不同料液比、超声温度及超声时间对松茸多糖得率的影响。每组进行3次平行测定，所得结果为3次测定的平均值。

（2）复合酶超声波辅助提取条件优化试验

准确称取5份质量为1.000 g的松茸粉，经超声波提取后，利用磷酸二氢钠和柠檬酸缓冲液调节pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，加入复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶为1∶1∶1）分别为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，在酶解温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下分别酶解30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，以多糖得率为评价指标，考察酶解pH、复合酶添加量、酶解温度及酶解时间对松茸多糖得率的影响。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

按紫外-可见分光光度法，在波长490 nm处测定吸光度值。以吸光度值（y）为纵坐标，葡萄糖标准溶液质量浓度（x）为横坐标，制得葡萄糖标准曲线见图1。由图1可知，葡萄糖标准曲线回归方程为y=9.5429x-0.0101，相关系数为R2=0.9992。结果表明，吸光度值与葡萄糖质量浓度在0～0.12 mg/mL的范围内有良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 超声波处理条件优化试验结果

2.2.1 料液比对松茸多糖得率的影响

由图2可知，当料液比为1∶15（g∶mL）时，松茸多糖得率最高。料液比较低时，溶液黏稠度过大，细胞没有得到充分空化，多糖提取不完全；而料液比过高，超声波的能量大部分被溶剂吸收，细胞中的多糖溶出较少，提取率降低。因此，选取最佳料液比为1∶15（g∶mL）。

图2 料液比对松茸多糖得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides

2.2.2 超声温度对松茸多糖得率的影响

图3 超声温度对松茸多糖得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides

由图3可知，多糖得率随着超声温度的升高而升高，当超声温度达到80℃时，多糖得率达到最高，随着超声温度进一步升高，多糖得率有所降低。其原因可能是超声温度升高，多糖的溶解度随之升高，当超声温度升高到一定程度，部分多糖发生水解，导致提取率降低。因此，选取最佳超声温度为80℃。

2.2.3 超声时间对松茸多糖得率的影响

图4 超声时间对松茸多糖得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides

由图4可知，当超声时间达到10 min时，多糖得率达到9.97%，此条件下多糖得率最高；当超声时间进一步延长，多糖在超声波的机械剪切和热作用下发生破坏和分解，多糖得率降低。因此，最佳超声时间为10 min。

2.2.4 超声波提取松茸多糖最佳工艺条件的确定

在单因素试验的基础上，采用正交试验对超声提取多糖工艺进行优化。选取超声温度（A）、料液比（B）、超声时间（C）进行L9（33）正交试验，以松茸多糖得率为评价指标，确定超声提取松茸多糖的最优工艺条件。正交试验结果及分析见表1，方差分析见表2。

表1 超声提取条件优化正交试验结果与分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of ultrasound extraction

表2 超声提取正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results of ultrasound extraction

由表1可知，各因素影响松茸多糖得率的主次顺序为B＞A＞C，即料液比＞超声温度＞超声时间。最佳因素水平组合是A3B2C3，即超声温度为90 ℃，料液比为1∶15（g∶mL），超声时间为15 min。并在此最优提取条件下进行验证试验，松茸多糖得率达到11.18%。由表2可知，超声温度和料液比对松茸多糖得率的影响达到显著（P＜0.05），超声时间对松茸多糖得率影响不显著（P＞0.05）。

2.3 超声波辅助复合酶法提取条件优化试验结果

在超声提取多糖的条件下，进一步进行复合酶法提取松茸多糖，以期提高多糖得率。

2.3.1 酶解温度对松茸多糖得率的影响

图5 酶解温度对松茸多糖得率的影响Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the yield of Tricholoma matsutakepolysaccharides

由图5可知，多糖得率随着酶解温度的升高而增加；当酶解温度为50℃时，多糖得率最大，为17.95%；之后随着酶解温度继续升高，多糖得率反而呈下降趋势。由于酶解温度升高，反应速度加快，酶的活性加强，当酶解温度高于一定范围，部分酶发生变性，导致失活，多糖得率也随之降低。因此最佳酶解温度为50℃。

2.3.2 酶解pH值对松茸多糖得率的影响

图6 酶解pH值对松茸多糖得率的影响Fig.6 Effect of enzymolysis pH value on the yield of Tricholoma matsutakepolysaccharides

由图6可知，随着酶解pH值的升高，多糖的提取率也明显增加；当pH值为5.0时，多糖得率最大，为18.05%；之后随着pH值的进一步增加，松茸多糖得率显著下降。因为pH值是影响酶活性的一个重要因素，在高于最适pH范围，酶的空间结构发生改变，活性遭到破坏，使得多糖提取率降低。因此最佳酶解pH值为5.0。

2.3.3 复合酶添加量对松茸多糖得率的影响

由图7可知，松茸多糖得率随着复合酶添加量的增加有明显上升趋势，当复合酶添加量达到3.5%之后，多糖得率达到平衡。由于复合酶添加量达到一定程度时，溶液呈现饱和状态，松茸的胞内多糖已基本溶出，多糖得率不再升高。因此最佳复合酶添加量为3.5%。

图7 复合酶添加量对松茸多糖得率的影响Fig.7 Effect of compound enzyme addition on the yield of Tricholoma matsutakepolysaccharides

2.3.4 酶解时间对松茸多糖得率的影响

图8 酶解时间对松茸多糖得率的影响Fig.8 Effect of enzymolysis time on the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides

由图8可知，随着酶解时间的延长，多糖得率也随之增加，当酶解时间达到60 min时，多糖得率最高，之后随着酶解时间进一步增加，多糖得率有缓慢下降趋势。这可能是因为酶解时间过短，酶解不充分，多糖溶出不彻底；而酶解时间过长，会导致多糖发生水解。因此，最佳酶解时间为60 min。

2.3.5 超声波辅助复合酶法提取松茸多糖最佳工艺条件的确定

在超声提取松茸多糖正交试验优化的基础上，选取酶解温度（A）、酶解时间（B）、复合酶添加量（C）、酶解pH值（D）4个因素中各选取3个具有代表性的水平，进行L9（34）正交试验，以松茸多糖得率为评价指标，最终确定超声波辅助复合酶法提取松茸多糖的最优工艺条件。正交试验结果及分析见表3，方差分析见表4。

由表3可知，各因素影响松茸多糖得率的主次顺序为C＞D＞A＞B，即复合酶添加量＞酶解pH值＞酶解温度＞酶解时间。最佳因素水平组合是A2B2C3D3，即酶解温度为50℃，酶解时间为60 min，复合酶添加量为4%，酶解pH值为6.0，并在此最优提取条件下进行验证试验，松茸多糖得率达到19.56%。由表4可知，复合酶添加量和酶解pH值对松茸多糖得率的影响达到极显著水平（P＜0.01），酶解温度对松茸多糖得率的影响均达到显著水平（P＜0.05），酶解时间对松茸多糖得率的影响不显著（P＞0.05）。

表3 超声波辅助复合酶法提取条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of ultrasound-assisted compound enzyme extraction

表4 超声波辅助复合酶法提取正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results of ultrasound-assisted compound enzyme extraction

3 结论

试验结果表明，采用复合酶超声辅助法提取松茸多糖效果显著，最佳提取工艺条件为料液比为1∶15（g∶mL），超声温度90℃条件下超声提取15 min后进行复合酶提取，酶解温度50℃，酶解时间60 min，复合酶添加量为4.0%，酶解pH 6.0，该条件下，松茸多糖提取率达到19.56%。复合酶超声辅助法提取松茸多糖比单用超声波法提取松茸多糖，提取率增加了8.38%。陈炼红等[21]采用复合酶法提取松茸多糖，得率为6.95%，相比之下，该方法的得率提高了12.61个百分点。关长亮等[22]采用纤维素酶辅助超声波法提取松茸多糖得率提高了5.59%。由此可以看出复合酶超声波辅助法提取松茸多糖是一种高效可靠的工艺，有一定实用价值。

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Ultrasound-assisted compound enzyme extraction technologyof polysaccharide from Tricholoma matsutake

CHEN Yan1,YAO Mi1,LI Meifeng1,MENG Xiao1,RAN Xu2

(1.School of Public Health,Chengdu University of TCM,Chengdu 611137,China;2.Department of Food Science and Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Using polysaccharide yield as evaluation index,the extraction condition was optimized by single factor test and orthogonal test.The results shown that the optimal ultrasonic extraction conditions were temperature 90 ℃,solid-liquid ratio 1∶15(g∶ml),time 10 min,which led to 11.18%polysaccharide yield.Based on the optimized result of ultrasonic extraction,compound enzymes treatment was further carried out.The extraction conditions were optimized by orthogonal experiments as follows:enzymatic hydrolysis temperature 50℃,hydrolysis time 60 min,compound enzyme(papain ∶cellulose enzyme∶pectinase 1∶1∶1)4.0%,buffer solution pH 6.0.In this condition,the yield ofTricholoma matsutakepolysaccharides was 19.56%.Compared with ultrasonic extraction,the extraction rate of polysaccharides fromT.matsutakeby ultrasonic-assisted compound enzyme extraction increased 8.38%.Thus,ultrasound-assisted compound enzyme extraction technology was a scientific and effective method,which can significantly improve the polysaccharide yield.

Tricholoma matsutake;polysaccharide;ultrasonic;compound enzyme;extraction technology

Q556；Q538

0254-5071（2017）10-0139-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.029

2017-07-22

成都中医药大学科技发展基金（ZRQN1604）

陈 艳（1987-），女，讲师，硕士，研究方向为保健食品学。