L-谷氨酸氧化酶的研究进展

于 爽，迟乃玉，张庆芳*

（1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连 116622）

L-谷氨酸氧化酶的研究进展

于 爽1，2，迟乃玉1，2，张庆芳1，2*

（1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连 116622）

L-谷氨酸氧化酶是一种潜在的十分有用的工具酶，其辅酶是黄素腺嘌呤二核苷酸，是一种黄素蛋白酶类。以L-谷氨酸为底物，将其降解为过氧化氢、氨和α-酮戊二酸，具有高度底物特异性。该文从L-谷氨酸氧化酶的来源、应用、克隆表达与分离纯化进行了阐述，并对其研究前景进行了展望。

L-谷氨酸氧化酶；来源；应用；克隆表达；纯化；研究前景

L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase，GLOD）是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）为辅酶的L-氨基酸氧化酶，能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化L-谷氨酸脱氨，生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢[1-2]。L-谷氨酸氧化酶对反应底物具有高特异性和高亲和力，反应条件温和，催化效率高，在食品、工业发酵及医药行业有广泛的应用。该酶自20世纪80年代发现以来，一直是国内外的研究热点，是潜在的工具酶之一。研究至今，国内外对L-谷氨酸氧化酶研究的热点主要集中在两方面，一是借助现阶段观察及测定方法研究酶的作用机制及结构，二是继续开发高产酶活性菌株及研究如何利用酶特性服务于人生活及工业应用。

1 L-谷氨酸氧化酶的来源

L-氨基酸氧化酶来源丰富，在蛇毒液[3]、许多动物和微生物中均能分离到，微生物来源较为广泛，但是其产酶能力均不高。现研究阶段，L-谷氨酸氧化酶多是从微生物中分离得到，其中链霉菌类产酶能力相比较其他菌种较强，其酶产量达到6.4 U/mL。L-谷氨酸氧化酶的首次发现是JURTSHUK和MEMANUS在维涅兰德固氮菌的膜制备物中发现的，但是其并不具有底物特异性[4]；真正意义上的首次证实是1983年KAMEI T等[5]在浅紫链霉菌（Streptomyces violascens）发酵液中证实了L-谷氨酸氧化酶的存在，其相对分子质量约为60 000，具有黄素蛋白特征的吸收光谱，不需要外源性辅助因子参与，但其专一性不强，对L-谷氨酸、L-谷氨酰胺及L-组氨酸均有作用。

20世纪90年代中国开始了对L-谷氨酸氧化酶的研究。1991年，徐水清等[6]在从土壤中分离出的放线菌中检测到了L-谷氨酸氧化酶活性，并研究了其产酶的影响因素。1992年，李青山等[7]对产酶菌株进行了选育诱变研究并成功得到一株高产酶菌株，固体发酵将其酶活提高了近25倍。而后又采用液体发酵优化发酵条件，酶活达到1.84 U/mg，相比固态发酵酶活提升了1.72倍。

2013年，卢婵等[8]将来自Streptomycessp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因与表达载体pET28a连接，导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，L-谷氨酸氧化酶比酶活达到1.1 U/mg。随后上3L发酵罐进行发酵，重组菌BL21（DE3）/pET28a-LGOX产L-谷氨酸氧化酶比酶活达到1.61 U/mg。近年来，国内外科学家分别从土壤中分离出了能产L-谷氨酸氧化酶的放线菌、链霉菌，完善了该酶发酵产酶体系，分离得到粗酶液，酶学性质研究表明，能高度专一分解L-谷氨酸生成氨、α-酮戊二酸和过氧化氢。

综上所述，自然界中产L-谷氨酸氧化酶的菌株很多，主要筛选到的菌株是放线菌及链霉菌。研究显示链霉菌产酶能力较好，更适合应用于工业生产。现阶段的研究方向主要是对该酶基因进行克隆并进行表达，提高其产酶能力，为更加广泛地应用提供基础。

2 L-谷氨酸氧化酶的应用

2.1 在生物传感器上的应用

L-谷氨酸在医药、食品添加剂、营养强化剂等领域具有十分广泛的作用[9]，但是其人均日允许摄入量不超6 g/d，食用过量L-谷氨酸会出现十分明显的中毒症状，表现在头痛、眩晕及脸部大量出汗[10]等。因此对于食品及临床样品中L-谷氨酸含量的检测是十分重要且必要的。L-谷氨酸常用的传统检测方法有电位滴定、华勃氏呼吸测定法和色谱分析[11]等，这些方法耗时耗力还需要高端精密设备[12]。因此考虑应用生物传感器来检测L-谷氨酸[13-14]，生物传感器具有快速、灵敏度高、设备简单等优点。

测定L-谷氨酸的生物传感器常采用L-谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶及谷氨酸脱氢酶作为酶膜[15]。L-谷氨酸氧化酶具有高度底物特异性，且不存在可逆反应等其他两种酶不具有的优势，因此广泛应用于生物传感器[16]，用于测定食品及临床样品中L-谷氨酸的含量及其偶联反应。

1989年WOLLENBERGER U等[17]打开了L-谷氨酸氧化酶在生物传感器上的应用开端，将L-谷氨酸氧化酶固定到过氧化氢电极上，该电极能稳定使用10 d以上并测定超过500个样品中0～0.14 g/L范围内的谷氨酸，测定时间仅为2 min。

1993年国内开始了对L-谷氨酸氧化酶生物传感器的研究，杨庆玲等[18]制成扩散控制型电极，并且应用该电极制备了流动注射分析系统，其方法是将L-谷氨酸氧化酶酶膜与过氧化氢探头复合。将L-谷氨酸准确测定范围增大到1.0 g/L，响应时间缩短20 s。2013年，怀红霞等[19]将L-谷氨酸氧化酶与纳米金材料固定到一起，纳米金材料具有表面自由能高、比表面积高等特性，极大地提高了测量精度，使其能准确测定0.2～2.0 g/L的谷氨酸含量。

谷氨酸生物传感器最初的研究集中在酶电极的制作。尽管十几年来人们不断改进固定工艺及应用新的材料，但由于酶的稳定性差及提取困难等弱点，其应用受到了极大的限制。随着微生物固定化技术的不断进步，以微生物活体为探测元的微生物电极应运而生，是当今的研究热点。

2.2 在测定转氨酶活性上的应用

临床医学上检验肝功能的重要指标是肝脏细胞中谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）与谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的含量，作用反应方程式[20]为：

检测其含量与活性的常规方法是丙酮酸氧化酶法[21]和赖氏法[22]。L-谷氨酸氧化酶对L-谷氨酸具有高度底物特异性，而谷草转氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）与底物反应会产生L-谷氨酸，因此将两个反应偶联用于测定谷草转氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）的活性与含量。

李青山等[23-24]利用L-谷氨酸氧化酶粗制品研究创立了利用分光光度计测定谷草转氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）的方法。比色法测得谷草转氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）的活性，显色反应为Trinder反应[25]，即H2O2与4-氨基安替吡啉偶联苯酚在过氧化物酶的催化下生成红色化合物。1995年，冯德荣等[26]研究并制作了测定转氨酶的生物传感器，将固定的L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢电极结合，谷丙转氨酶（ALT）酶活力在4～106 U/L、谷草转氨酶（AST）酶活力在21～129 U/L范围内该装置具有较好的精确性。

2.3 在测定肌酐上的应用

血肌酐的含量是临床用于检测肾功能的参数之一。肌氨酸氧化酶法[27]和碱性苦味酸法[28]常用于测定肌酐的含量，测定反应方程式为：

1993年，RUI C S等[29]利用L-谷氨酸氧化酶创立了流动注射系统测定血肌酐的含量。其特色性的采用双通路测定来避免血液中内源性谷氨酸和氨对测定的影响。第一响应为内源性氨谷氨酸和肌酸酐的总和响应；第二响应为内源性氨和谷氨酸的响应，其测量范围分别达到为2 mmol/L和3 mmol/L。该系统具备良好的稳定性和重现性，与化学方法获得的化验结果中肌酐的含量呈良好的相关性。

3 L-谷氨酸氧化酶的克隆表达及酶分离纯化研究

L-谷氨酸氧化酶的发酵生产受到很多因素的影响，其中最大的影响因素是至今为止所筛选到的菌株产酶能力不强，其次就是发酵条件及分离纯化技术的影响。

3.1 L-谷氨酸氧化酶的克隆表达

L-谷氨酸氧化酶距工业化发酵生产还有很大的距离，很大程度上限制了其应用。因此需要进一步提高其产酶能力，充分发挥菌株的生产能力，显著提高发酵产量。

L-谷氨酸氧化酶研究至今，国内外所见报道中L-谷氨酸氧化酶产酶能力均不强，极大的限制了其应用，因此采用基因工程的方法构建工程菌来提高产酶能力是十分重要且常见的手段。2001年，CHEN C Y等[30]对灰色链霉菌（Streptomyces platensis）NTU3304的L-谷氨酸氧化酶基因进行了克隆研究，他们将产酶基因克隆重组在变铅青链霉菌中。研究结果显示，该产酶基因全长2 130 bp，由710个密码子组成，前体分子质量大小为78 ku，成熟后分子质量大小为76 ku，由三个亚基组成。

2013年，卢婵等[31]将Streptomycessp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因克隆重组，并在原核表达载体大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。研究结果显示L-谷氨酸氧化酶比酶活达到1.1U/mg；而后又进行了3L发酵罐发酵产酶研究，结果显示重组产酶菌产L-谷氨酸氧化酶比酶活达到1.61U/mg。

目前，美国Sigma公司已利用基因工程技术，以大肠杆菌为宿主菌构建了产酶工程菌，极大提高了产酶能力和稳定性，并将其应用于商业化生产，为其进一步研究应用创造了条件。

3.2 L-谷氨酸氧化酶的分离纯化研究

最近几十年，L-谷氨酸氧化酶因为其实用性收到了广泛的关注，但至今商业化用酶国内仍没有实现量产，主要依靠国外进口，价格昂贵，主要原因是酶的分离纯化困难，极大限制了应用。目前，L-谷氨酸氧化酶的主要分离纯化方法仍是一些常规柱层析方法，常见的包括离子交换层析、高压液相层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。

KAMEI T等[32]最早开始了对L-谷氨酸氧化酶纯化的研究，他们将粗酶液经硫酸铵沉淀透析后，经过L-谷氨酸氧化酶-琼脂糖凝胶6B层析柱、L-谷氨酰胺-琼脂糖凝胶6B层析柱、羟基磷灰石柱，葡萄糖G-100层析柱纯化后获得纯化酶。纯化后比酶活达到60.3 U/mg，纯化倍数达914倍，回收率为27.5%。

SUKHACHEVA M V等[33]先将粗酶液经过硫酸铵沉淀，而后经过用DEAE纤维素柱和葡聚糖凝胶G-25凝胶过滤获得纯化酶，纯化后酶液比酶活达到50.8 U/mg，纯化倍数达907倍。徐水清[34]将0.041 4 U/mg的粗酶液经过硫酸铵沉淀，DEAE纤维素柱，葡聚糖凝胶G-25处理后，酶活达到4.11 U/mg，纯化倍数为99倍。他们所使用的分离纯化方法和SUKHACHEVA M V等[33]相同。沈群[35]采用的分离纯化方法更为方便，但是其纯化效果不是特别理想，其将L-谷氨酸氧化酶粗酶液经过硫酸铵沉淀后直接用聚丙烯酰胺葡聚糖S-200-HR分子筛过滤。结果显示，粗酶液比酶活为0.009 5 U/mg，经纯化后，获得酶活为0.087 U/mg的酶液，纯化倍数为9.2倍，回收率为2.7%。李玲等[36]利用华美链霉菌（Streptomycessplendeds）4.66发酵生产L-谷氨酸氧化酶，而后对酶进行了分离纯化研究。其采用的方法更为完善，首先将粗酶液进行高速冷冻离心，后进行硫酸铵分级沉淀，而后用SephadxG-25进行脱盐，然后进行MonoQ离子交换、SuperdexG-200凝胶层析及冷冻干燥等步骤得到纯化的L-谷氨酸氧化酶。纯化后的L-谷氨酸氧化酶比酶活为176U/mg，纯化倍数为926倍，回收率为12.95%。卢婵等[31]将粗酶液经过高速离心后进过硫酸铵沉淀，HisTrapTMFF亲和层析后获得单一的L-谷氨酸氧化酶蛋白条带，纯化后L-谷氨酸氧化酶比酶活为2.1 U/mg，蛋白纯化倍数为1.9倍。

4 前景与展望

21世纪注定是生物技术产业蓬勃发展的时代，酶制剂作为生物技术产业的中流砥柱发展十分迅速。究其原因，其应用范围十分广泛，在食品、造纸、医药、临床医学、工业发酵等行业均有十分重要的作用。近几十年许多工业生产工艺的革新，对酶制剂的需求提高导致我国酶制剂产业发展更为迅猛，每年酶制剂产量达上百万吨，经济产值巨大。

L-谷氨酸氧化酶作为一种较新的实用工具酶，目前国内仍未能实现酶制剂的工业化生产；另外其作用机制及蛋白质三维结构罕见报道。希望在不久的将来，随着生物技术及分子生物技术的进步，研究者们能够阐明其作用机理，构建出更适用于工业生产的工程菌，使其能够得到更加广泛的应用，造福于人类的生产与生活。

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Research progress on L-glutamate oxidase

YU Shuang1,2,CHI Naiyu1,2,ZHANG Qingfang1,2*
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China;2.Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China)

L-glutamate oxidase is a potentially useful tool enzyme,and it is a flavoprotein with FAD as coenzyme.Using L-glutamate as substrate,L-glutamate oxidase catalyzes L-glutamic acid into hydrogen peroxide,ammonia and α-ketoglutaric acid with high substrate specificity.In this overview,the L-glutamate oxidase sources,application,cloning and expression,isolation and purification were summarized,and the research prospects of the L-glutamate oxidase were proposed.

L-glutamate;source;application;cloning and expression;purification;research prospects

Q554

0254-5071（2017）10-0009-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.003

2017-03-04

辽宁省教育厅高等教育内涵发展专项资金项目；辽宁省教育厅生物工程培养模式改革专业项目（GM201418）

于 爽（1986-），女，实验师，硕士，研究方向为微生物与酶工程。

*通讯作者：张庆芳（1965-），女，教授，博士，研究方向为微生物与酶工程。