中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究

亓秀晔，谢全喜，陈 振，于佳民，曾佳佳，徐海燕，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000）

中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究

亓秀晔，谢全喜，陈 振，于佳民，曾佳佳，徐海燕，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000）

该实验旨在利用芽孢杆菌（Bacillus）和乳酸杆菌（Lactobacillus）发酵棉粕，研究对棉粕中游离棉酚降解率及饲料活菌数的影响。研究发现，芽孢杆菌BLCC1-0039在37℃发酵24 h后棉酚降解率达到85.89%（P＜0.05），产中性蛋白酶活性达到2 811.40 U/g发酵料（P＜0.05）；发酵48 h时棉酚降解率达到91.47%，产中性蛋白酶活性达到2303.24 U/g。单独添加中性蛋白酶发酵24 h时，添加量为1 000 U/g的棉酚降解率已达到58.46%，2 000 U/g时棉酚降解率达到72.68%；发酵48 h时1 000 U/g的棉酚降解率已达到73.29%。乳酸菌发酵棉粕不能降解棉酚，但乳酸杆菌BLCC2-0092添加1 000 U/g的中性蛋白酶发酵24 h时，棉酚降解率达到67.13%，pH值降至4.71。

中性蛋白酶；棉酚；棉粕；芽孢杆菌；乳酸杆菌

我国蛋白质饲料资源严重短缺，而棉粕产量高且价格低廉，棉粕蛋白含量高达38%～50%，粗纤维约11%，此外B族维生素、硫胺素和有机磷也比较多[1-2]，同大豆粕一样是重要的蛋白质饲料资源[3]。然而，棉籽饼中含有棉酚、环丙稀脂肪酸、单宁等抗营养因子物质，其中最主要的是棉酚，如果未经脱毒长期饲喂畜禽，则很易引起中毒甚至死亡，严重降低饲用价值[4-5]。目前，降解棉酚的方法主要有化学法、物理法和微生物发酵法等，其中微生物发酵法可以将棉酚转化为其他物质，达到脱毒目的，既不产生其他副产物，又可提高粗饲料的营养价值，增加适口性和采食量，是目前普遍认为的成本低、效果好、较安全的脱毒方法[6-8]。但不同微生物菌种对棉酚的降解能力有较大的差异，筛选优良的微生物菌种是影响棉籽饼粕脱毒效果和营养价值的首要步骤。

中性蛋白酶主要作用为在中性条件下水解蛋白质的肽键，释放氨基酸或者多肽，最早发现并应用于生产的工业酶制剂，现已广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面[9]，近年来更发展出许多新的用途[10-11]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是美国食品药物管理局公布的安全菌种[12]，是当今工业酶的主要生产菌种之一，是工业生产上应用最广泛的菌种之一，其产中性蛋白酶能力为芽孢菌生长的主要的考察指标[13]。据报道，枯草芽孢杆菌发酵棉粕，特别是加入木瓜蛋白酶后可有效提高棉粕的营养价值[14]。目前报道的用于棉籽饼粕脱毒的芽孢菌的相关研究有枯草芽孢杆菌菌株M-9[15]和菌株M-4[16]，这两株菌对棉酚具有较高的降解活性。乳酸菌发酵饲料作为功能性饲料，具有气味香、适口性好、饲喂简单方便、消化率高、功效稳定等优势，具有良好的生产和应用价值[17-18]。但是两种菌单独发酵时也存在一定不足，如枯草芽孢菌发酵过程中脱羧或脱氨作用会产生有机酸和氨气，会有刺鼻的氨味，乳酸菌降解棉酚效果不显著等。本研究旨在利用芽孢杆菌和乳酸杆菌对棉粕进行固态发酵，充分利用两种菌的优势，达到降低棉酚含量，同时提高棉粕蛋白利用率，改善棉粕品质的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 发酵原材料及菌株

棉粕由新疆泰昆生物集团提供，粉碎过40目筛。

芽孢杆菌（Bacillus）菌株：BLCC1-0039、BLCC1-0090、BLCC1-0157和BLCC1-0169；乳酸杆菌（Lactobacillus）菌株：BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0112和BLCC2-0111，均由山东宝来利来生物工程股份有限公司保存。中性蛋白酶（酶活性50 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司。

1.1.2 培养基

酵母膏蛋白胨培养基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、酵母膏0.5%，pH值7.0，121℃灭菌20 min。

MRS培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.3 g/L，柠檬酸铵2 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温-80 1 mL/L，pH值6.0，121℃灭菌20 min。

1.1.3 化学试剂

葡萄糖：山东祥瑞药业有限公司；硫酸镁、硫酸锰：济南汇丰达化工有限公司；柠檬酸铵：上海抚生实业有限公司；乙酸钠：青岛捷世康生物科技有限公司；吐温-80、氢氧化钠、磷酸、氯化钠：天津博迪化工股份有限公司；以上试剂均为分析纯。乙腈、丙酮（色谱级）、甲醇（色谱级）：天津市永大化学试剂有限公司；微孔滤膜（直径13mm、孔径0.45μm）：上海安谱有限公司；棉酚标准品（纯度98%）：上海源叶生物科技有限公司。蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；牛肉膏、酵母膏：天津市英博生化试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9082电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒温振荡器：扬州培英实验仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；LDE-2A低速离心机：北京时代北利离心机有限公司；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE52CS旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SB1200超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；LC-20AT液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 种子液制备

取经过两次活化的芽孢菌斜面一环于装有100 mL酵母膏蛋白胨培养基的500 mL三角瓶中，于37℃、180 r/min摇床培养24 h，待用。取经过两次活化的乳酸菌斜面一环于装有100 mL MRS培养基的500 mL三角瓶中，37℃静置培养24 h待用。

1.3.2 芽孢杆菌的筛选

生料发酵。称取一定量的基料于1 000 mL三角瓶中，料水比为1∶0.4（g∶mL），装量100 g/瓶，按2%接种量分别接入培养好的芽孢菌种子液，每个样品设3个平行，以不接种任何菌株的空白料为对照，均置于37℃培养箱进行需氧发酵，分别于发酵24h和48h取样，测定发酵样芽孢菌活菌数、中性蛋白酶活性及棉酚含量。优选芽孢菌活菌数较高、产中性蛋白酶活性较高并能有效降解棉酚含量的菌株。

1.3.3 乳酸杆菌的筛选

生料发酵。称取一定量的基料装袋，料水比为1∶0.4（g∶mL），装量100 g/袋，按2%接种量分别接入培养好的乳酸菌种子液，密封。每个样品设3个平行，以不接种任何菌株的空白料为对照，均置于37℃培养箱进行厌氧发酵，分别于发酵24 h和48 h取样，测定发酵样乳酸菌活菌数、pH值及棉酚含量。优选乳酸菌活菌数较高且pH值较低的菌株。

1.3.4 棉粕中添加不同浓度中性蛋白酶发酵

生料发酵。称取一定量的基料装袋，装量100 g/袋，设置中性蛋白酶浓度梯度为0、1 000 U/g、2 000 U/g、4 000 U/g和8 000 U/g基料，按照料水比1∶0.4（g∶mL）先溶解中性蛋白酶，完全加入基料中，混匀，密封。每个样品设3个平行，均置于37℃培养箱进行厌氧发酵，分别于发酵24 h和48 h取样，测定发酵样棉酚含量。

1.3.5 乳酸菌加中性蛋白酶发酵

生料发酵。称取一定量的基料装袋，装量100 g/袋，根据1.3.4种筛选的最优中性蛋白酶添加量1 000 U/g基料，按照料水比1∶0.4（g∶mL）先溶解中性蛋白酶，完全加入基料中，混匀，密封。每个样品设3个平行，均置于37℃培养箱进行厌氧发酵，分别于发酵24 h和48 h取样，测定发酵样乳酸菌活菌数、pH值及棉酚含量。

1.3.6 测定指标及方法

（1）pH值的测定

取10g样品加入90mL灭菌后的生理盐水中，搅拌均匀后直接测定。

（2）芽孢杆菌和乳酸杆菌活菌数的测定

准确称取发酵棉粕10.0 g，用生理盐水10倍递增稀释，取适当稀释度的样品分别至酵母膏蛋白胨培养基及MRS培养基中，37℃培养48 h，根据菌落数计算样品中芽孢杆菌和乳酸杆菌活菌数，结果用CFU/g发酵料表示。

（3）中性蛋白酶活性的测定

取发酵棉粕1.0 g，采用福林-酚试剂法测定样品中中性蛋白酶活性。中性蛋白酶酶活定义：1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g表示。

（4）棉酚含量的测定[19]

棉酚标准溶液的配制：准确称取棉酚标准品用乙腈-0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶解得到1.21 mg/mL的标准品贮备液，贮备液再用乙腈-0.2%磷酸（体积比为85∶15）稀释成121 μg/mL的标准品工作液。用流动相将标准品工作液逐级稀释得到质量浓度分别为61.50 μg/mL、20.17 μg/mL、5.04 μg/mL、2.52 μg/mL和1.21 μg/mL的标准工作液，以峰面积（X）和质量浓度（Y）作图，得到标准曲线回归方程为：Y=0.000 005 45X+0.160 525（R2≥0.999 96），线性范围为1.21～121.00 μg/mL。

待测样品游离棉酚的提取：准确称取待测样品3.00 g，加入丙酮30 mL，超声提取30 min，3 000 r/min 25℃离心10 min，重复提取3次，合并上清液。全部转移至蒸发瓶中，旋转蒸发至干，用乙腈-0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液溶解，多次超声清洗转移至25 mL容量瓶，定容，过0.22 μm滤膜后供高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）测定。棉酚含量计算公式如下：

式中：c为棉酚溶液的质量浓度，μg/mL；m为样品质量，g。高效液相色谱（HPLC）法测定棉酚含量：色谱柱为Intertsil RODS-2（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液，流速1.0 mL/min，紫外检测波长235 nm，进样量20 μL，柱温25℃。

1.3.7 数据分析

试验数据用Excel软件进行初步处理后，采用SPSS13.0进行统计分析，采用ANOVA进行方差分析，最小显著差异法（leastsignificantdifference，LSD）法进行组间多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的筛选

不同芽孢杆菌发酵棉粕对饲料品质的影响见表1。由表1可知，除菌株BLCC1-0040在发酵24 h和48 h时活菌数在108CFU/g水平外，其余菌株均在109CFU/g水平，48 h时菌株BLCC1-0039、BLCC1-0157和BLCC1-0169均达到1010CFU/g水平，且各取样时间点的中性蛋白酶活性也均在1 000 U/g以上，以菌株BLCC1-0039最高，发酵24 h时，中性蛋白酶活性高达2 811 U/g，显著高于其他组（P＜0.05），棉酚含量最低，降解率达到85.89%，其次为菌株BLCC1-0157，中性蛋白酶活性为1 716 U/g，棉酚降解率为81.95%，均显著高于其他三组菌株发酵（P＜0.05）。发酵48 h时，菌株BLCC1-0039产中性蛋白酶活性达到2 303.24 U/g，棉酚降解率达91.47%，与其他菌株发酵差异显著（P＜0.05）。综上所述，芽孢杆菌BLCC1-0039产中性蛋白酶活性高、降解棉酚能力强，最适宜发酵棉粕。

表1 不同芽孢杆菌发酵棉粕对饲料品质的影响Table 1 Effect ofBacillusspp.on fermented feed quality

2.2 乳酸杆菌的筛选

表2 不同乳酸杆菌发酵棉粕对饲料品质的影响Table 2 Effect ofLactobacillusspp.on fermented feed quality

不同乳酸杆菌发酵棉粕对饲料品质的影响见表2。由表2可知，发酵24 h时除菌株BLCC2-0112活菌数在108CFU/g水平外，其余菌株均在109CFU/g水平，差异不显著（P＞0.05）；pH值方面，发酵24 h时菌株BLCC2-0092和BLCC2-0001发酵的饲料pH值最低，分别为5.47和5.49，其次为菌株BLCC2-0015（5.77），48 h时三株菌发酵棉粕的pH均降至5.00以下，其中菌株BLCC2-0092发酵48 h时最低达到4.67；棉酚含量方面，各菌株间差异不显著（P＞0.05），与对照相比几乎均没有降解棉酚的能力。综合发酵活菌数和降低pH值结果来看，乳酸杆菌BLCC2-0092、BLCC2-0001和BLCC2-0015较适宜发酵棉粕，其次为菌株BLCC2-0111。

2.3 中性蛋白酶对棉酚含量的影响

由表3可知，添加中性蛋白酶发酵棉粕降低了棉酚含量，24 h时，中性蛋白酶添加量1 000 U/g时棉酚降解率已达到58.46%；2 000 U/g的添加量时棉酚降解率最高，达到72.68%；超过2 000 U/g时，棉酚降解率并没有随着中性蛋白酶添加量的升高而继续升高。48 h时，1 000 U/g时棉酚降解率最高为73.29%。说明适量中性蛋白酶的添加可有效降解棉酚，1 000 U/g的中性蛋白酶添加量已达到较优效果。

表3 不同中性蛋白酶添加量发酵对棉粕中棉酚含量的影响Table 3 Effect of neutral protease addition on fermented feed quality

2.4 乳酸杆菌加中性蛋白酶发酵棉粕对饲料品质的影响

乳酸杆菌加中性蛋白酶（1 000 U/g）发酵棉粕对棉酚含量的影响见表4。由表4可知，添加中性蛋白酶的乳酸杆菌发酵有效降解了棉粕中棉酚含量，菌株BLCC2-0092降解棉酚效果较好，24 h时棉酚降解率达到67.13%，其次为菌株BLCC2-0001，棉酚降解率为60.43%，均显著高于菌株BLCC2-0015（P＜0.05）和BLCC2-0111（P＜0.05），后两者的棉酚降解率也达到了47.0%以上；48 h时，四株乳酸杆菌棉酚降解率均在50%以上，均优于乳酸菌单独发酵时的棉酚降解率（见表2）。活菌数在109CFU/g水平，以菌株BLCC2-0001和BLCC2-0092发酵的活菌数较高。pH值方面，菌株BLCC2-0001和BLCC2-0092较低，发酵24 h时pH值分别为4.62和4.71，显著低于其他两株（P＜0.05）。

表4 乳酸杆菌加中性蛋白酶发酵棉粕对饲料品质的影响Table 4 Effect ofLactobacillusspp.with neutral protease on fermented feed quality

综上所述，添加中性蛋白酶的乳酸杆菌发酵可有效降解棉粕中棉酚含量，菌株BLCC2-0092添加1000U/g的中性蛋白酶发酵24 h时棉酚降解率为67.13%，pH值为4.71，效果最优。

3 结论

本实验旨在利用芽孢杆菌和乳酸杆菌发酵棉粕，研究对棉粕中游离棉酚降解率及饲料品质的影响。研究发现：芽孢杆菌发酵棉粕降解棉酚效果与菌株产中性蛋白酶的高低有关，棉酚降解率最优的芽孢杆菌为BLCC1-0039，37℃发酵24 h时，棉酚降解率已达到85.89%，产中性蛋白酶活性达到2 811.00 U/g发酵料；发酵48 h时，产中性蛋白酶活为2 303.24 U/g，棉酚降解率达91.47%，与其他菌株差异显著（P＜0.05）。芽孢杆菌发酵棉粕可产生降解棉酚的物质，其中中性蛋白酶起着重要作用：单独添加中性蛋白酶发酵24 h时，1 000 U/g的添加量棉酚降解率已达到58.46%，2 000 U/g的添加量时棉酚降解率达到72.68%；48 h时，1000U/g中性蛋白酶添加量的棉酚降解率最高为73.29%。乳酸杆菌无降解棉酚的能力，但乳酸杆菌BLCC2-0092添加1 000 U/g的中性蛋白酶发酵24 h时，棉酚降解率达到67.13%，pH值降至4.71。

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Degradation of cottonseed meal gossypol by neutral protease

QI Xiuye,XIE Quanxi,CHEN Zhen,YU Jiamin,ZENG Jiajia,XU Haiyan,GU Wei
(Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

UsingBacillusandLactobacillusto ferment cottonseed meal,the effects of strains on the degradation rate of free gossypol and feed quality was studied.Results indicated that withBacillusBLCC1-0039 cultured at 37℃for 24 h,the degradation rate of gossypol was 85.89%(P＜0.05),and the activity of neutral protease was up to 2 811.40 U/g(P＜0.05).With fermentation for 48 h,the degradation rate of gossypol was 91.47%(P＜0.05),and the activity of neutral protease was up to 2 303.24 U/g.With the addition of 1 000 U/g neutral protease individually for 24 h fermentation,the degradation rate of gossypol was 58.46%,however,with the addition of 2 000 U/g neutral protease individually,the degradation rate of gossypol reached 72.68%.With the addition of 1 000 U/g neutral protease for 48 h fermentation,the degradation rate of gossypol reached 73.29%.Lactobacillus sp.can not degrade gossypol,but after the strain BLCC2-0092 fermentation with 1 000 U/g neutral protease for 24 h,the gossypol degradation rate reached 67.13%,pH value decreased to 4.71.

neutral protease;gossypol;cottonseed meal;Bacillus;Lactobacillus

TQ920.6

0254-5071（2017）10-0144-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.030

2017-05-04

泰安市科技发展计划（201540701）

亓秀晔（1987-），女，助理研究员，硕士，主要从事动物微生态制剂研发工作。