斑蝥素半乳糖化脂质体冷冻干燥工艺及性质研究

乔勇 唐颖楠 周莉莉 邹蔓姝 夏新华

摘要：目的  制备斑蝥素半乳糖化脂质体（Lac-CTD-Lips）冻干粉，并对其理化性质进行考察。方法  利用冷冻干燥法制备Lac-CTD-Lips冻干粉，以粒径、外观、复溶时间及复溶后外观为指标，采用单因素试验筛选冻干处方最佳工艺，考察冻干前后脂质体的形态学变化、粒径、pH值及包封率。结果  采用内外加法，冻干保护剂的质量浓度为20%，甘露醇-海藻糖比为3∶2，以速冻的方式，于-50 ℃冻干机冷阱预冻，冷冻干燥24 h，可获得较满意的冻干粉。与冻干前比较，冻干后脂质体形态未发生明显变化;冻干前后脂质体的粒径分别为（211.6±0.05）nm、（233.2±0.12）nm，Zeta电位分别为（0.08±0.01）mV、（-3.30±0.21）mV，包封率分别为（86.11±0.64）%、（84.20±0.15）%。结论  Lac-CTD-Lips冻干工艺稳定、可行，可为其进一步研究奠定基础。

关键词：斑蝥素;半乳糖化脂质体;冻干粉;粒径

中图分类号：R283.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）10-0070-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.016      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To prepare lyophilized powder of cantharidin galactosylated liposome （Lac-CTD-Lips）; To investigate its physical and chemical properties. Methods Lac-CTD-Lips lyophilized powder was prepared by using freeze-drying method. With particle size， appearance， resolution time and reconstituted appearance as indexes， single factor test was used for the optimization of the process of freeze-drying prescription. The morphological changes， particle size， pH value and encapsulation efficiency of liposomes before and after lyophilization were investigated. Results Using internal and external addition， the concentration of the lyoprotectant was 20%， and the mannitol-trehalose ratio was 3：2. In the form of quick freezing， the freeze-drying process was as follows： pre-frozen at -50 ℃ in a cold-drying machine， then freeze-dried for 24 hours to obtain lyophilization powder. Compared with before lyophilization， no significant change in morphology occurred during this lyophilization process. The particle sizes of the pre and post freeze-drying process were （211.6±0.05）nm and （233.2±0.12）nm， Zeta potential were （0.08±0.01）mV and （-3.30±0.21）mV， the encapsulation efficiency were （86.11±0.64）% and （84.20±0.15）%， respectively. Conclusion Freeze-drying process of Lac-CTD-Lipsis is stable and feasible， which can build a solid foudation for further study.

Keywords： cantharidin; galactosylated liposomes; freeze-drying powder; particle size

目前肝癌主要采用手术和药物治疗，其中手術治疗占主要地位，而现有的抗癌药物生物利用率低，毒副作用大，且易产生耐药性，对肿瘤组织特异性差，常引起多重不良反应[1]。因此，开发高效低毒且具有靶向性的抗肝癌制剂势在必行[2-4]。

斑蝥素（cantharidin，CTD）是斑蝥体内提取的倍半萜类衍生物。研究表明，斑蝥素具有增强机体免疫功能、改变多种蛋白表达、抑制肿瘤细胞增殖等药理作用[5-6]。但斑蝥素水溶性差、口服生物利用度低、毒性大，限制了其在临床肿瘤治疗方面的应用[7-10]。脂质体是由脂质双分子层所形成的一种超微球形载体制剂，是纳米载药系统的典型代表。目前，以新型脂质体为载体的多种药物递送系统在介导基因治疗、靶向给药、抗肿瘤等方面显示出独特的优势[11]。

普通斑蝥素脂质体（CTD-Lips）易被机体免疫识别吞噬。肝实质细胞内存在去唾液酸糖蛋白受体（asialogly-coprotein receptor，ASGPR），亦称半乳糖受体，可高效识别半乳糖残基，本课题组前期合成了肝靶向分子硬质醇乙酰化半乳糖苷，并对斑蝥素半乳糖化脂质体（Lac-CTD-Lips）的处方配比和制备工艺进行了优选[12]，制备出的Lac-CTD-Lips可靶向于肝脏，既提高药物在病灶的局部浓度，又减少药物对其他非靶向组织的毒副作用。然而，液态Lac-CTD-Lips在贮存期间易发生聚集、融合及药物渗漏;同时，天然磷脂易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求[13]。真空冷冻干燥技术制备冻干脂质体是目前提高脂质体稳定性以解决液态脂质体无法长期贮存问题的最佳方法。冻干制剂特有的疏松多孔结构，可使药物易于重新复溶而恢复活性;而且冻干制剂含水量低，易于长期稳定保存，可有效避免脂质体以水溶液方式贮存而导致的一系列问题[14-16]。本研究制备Lac-CTD-Lips冻干粉，优化冻干处方工艺，并考察冻干制剂的理化性质，为探索解决脂质体类制剂的贮存稳定性问题提供依据。

2.4.4  冻干保护剂内加海藻糖量考察

本试验固定冻干保护剂的质量浓度为20%，甘露醇与海藻糖的配比为3∶2，设计内加海藻糖量分别为海藻糖总量的0%、12.5%、25.0%、37.5%（即外加甘露醇与海藻糖的配比分别为3∶2、3∶1.75、3∶1.5、3∶1.25）。结果表明，脂质体进行冷冻干燥时，内加海藻糖量为海藻糖总量的37.5%为佳。见表4。

2.5  斑蝥素冻干脂质体最佳制备方法验证

采用乙醇注入法制备Lac-CTD-Lips，即精密称取斑蝥素、磷脂、胆固醇、十八醇半乳糖苷适量，溶于一定量的无水乙醇，超声溶解后，将其缓慢滴入预热的pH 6.4磷酸盐缓冲液中，并置于55 ℃水浴中搅拌（转速200 r/min）。减压蒸馏除去无水乙醇，用磷酸盐缓冲液定容，探头超声（冰浴）20 min，分别采用0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜过滤进行整粒，即得Lac-CTD-Lips。移取2 mL脂质体溶液至含0.75海藻糖的称量瓶中，外加3∶1.25甘露醇-海藻糖（冻干保护剂的质量浓度为20%，甘露醇∶海藻糖=3∶2），摇匀，将样品以速冻方式（-50 ℃）进行预冻。预冻12 h后开启真空泵，减压至1 Pa，真空干燥24 h，即得Lac-CTD-Lips冻干品。

2.6  冻干前后理化性质考察

2.6.1  外观形态

乙醇注入法制备的Lac-CTD-Lips外观为半透明胶体溶液，有淡蓝色乳光;冻干品外观饱满，可见明显的疏松结构，呈白色;复溶后脂质体为乳白色半透明胶体溶液。

2.6.2  透射电镜观察

取适量冻干前和冻干后复溶的Lac-CTD-Lips混悬液样品，用2%磷钨酸负染法制样，干燥后置于透射电镜下观察脂质体形态，结果见图2、图3。在透射电镜下，Lac-CTD-Lips外观圆整、大小均一，冻干后复溶的Lac-CTD-Lips为不规则圆形球粒，分散均匀。

2.6.3  粒径

取适量冻干前及冻干后复溶的脂质体混悬液样品，于Nano ZS納米粒度及Zeta电位仪测定其平均粒径及分布。结果表明，相对于冻干前，冻干后脂质体粒径稍有增大，冻干前Lac-CTD-Lips的平均粒径为（211.6±0.05）nm，复溶后平均粒径为（233.2±0.12）nm，二者粒径分布图均呈现一个单峰，见图4。

2.6.4  Zeta电位

取少量冻干前与冻干后复溶的脂质体混悬液，稀释相同倍数，用Nano ZS纳米粒度及Zeta电位仪测定其Zeta电位。结果显示，Lac-CTD-Lips冻干前的Zeta电位为（0.08±0.01）mV，复溶后Zeta电位为（-3.30±0.21）mV，表明冻干前后电位无明显变化，见图5。

2.6.5  pH值

取冻干前与冻干后复溶的脂质体混悬液适量，用pH计测定Lac-CTD-Lips冻干前后样品pH值，结果见表5。

2.6.6  包封率

精密量取冻干前与冻干后复溶的Lac-CTD-Lips混悬液各1 mL，加入9 mL甲醇-乙腈混合溶液，超声使其澄清，微孔滤膜过滤后HPLC进样分析，计算总药量。另精密量取冻干前与冻干后复溶的脂质体溶液各0.5 mL，加于Sephadex G-50凝胶柱顶部（直径1.5 cm，柱床高20 cm），以蒸馏水洗脱，洗脱流速为2 mL/min。收集22～46 mL脂质体部分，减压蒸至1 mL，用甲醇-乙腈混合溶液定容至10 mL，超声使其澄清，过0.22 μm微孔滤膜，HPLC进样分析，计算包封的药物含量，计算其包封率。包封率（%）=系统中包封的药量÷系统中总药量×100%。结果表明，冻干前后脂质体的包封率变化不大，见表6。

3  讨论

本试验对乙醇注入法制得的Lac-CTD-Lips进行冷冻干燥研究，以冻干样品外观、粒径、复溶时间及复溶后外观为评定指标，考察预冻方式、干燥时间、冻干保护剂种类、加入方式及用量对冻干前后脂质体的影响，最终确立Lac-CTD-Lips的最优冻干工艺条件为：加入质量浓度为20%的甘露醇-海藻糖（3∶2）作为冻干保护剂，速冻温度为-50 ℃，预冻时间为12 h，干燥时间为24 h。

筛选冻干保护剂发现，单一冻干保护剂难以满足脂质体系统的需要，故考虑将2种冻干保护剂联用。试验结果表明，对于Lac-CTD-Lips，将甘露醇和海藻糖联用，并采用内外加法（先内加适量海藻糖再外加联用冻干保护剂）可获得较好的冻干效果。

对Lac-CTD-Lips冻干制剂进行了制剂学评价，考察了脂质体冻干前后形态学变化，结果表明，冻干脂质体可见明显的疏松结构，外形饱满，色泽均匀;冻干品再分散性良好，复溶性较好，60 s内即可溶解完全;脂质体冻干后粒径略有增大，Zeta电位无明显变化，体系稳定性没有降低;包封率>80%。

冷冻干燥过程对脂质体磷脂双分子层有一定破坏作用，易造成脂质体融合和药物泄漏。一方面，由于冷冻时外水相先形成冰晶，导致外水相盐浓度增大，脂质体膜内外渗透压增大，药物容易泄漏;另一方面，干燥时，脱水作用破坏磷脂与水分子之间的氢键，促使脂质体膜发生融合[17]。糖类作为冻干保护剂，可有效防止以上现象发生，其机制主要为水置换假说[18]。由于糖类自身带有多羟基结构，在冷冻干燥过程中，可代替失去的水分子，与磷脂极性基团相结合形成氢键，对脂质体进行保护，维持脂质体结构的完整性[19]。

本试验利用磷脂对脂溶性药物斑蝥素的包覆，促进药物在水性介质中的分散，针对性地解决了斑蝥素用于临床的一些缺点，并为其他脂溶性药物开发提供了新的研究途径。利用冷冻干燥技术将Lac-CTD-Lips制成冻干制剂，有助于提高其贮存的稳定性，并可为进一步开展Lac-CTD-Lips肝靶向性与抗肝肿瘤作用研究奠定基础。

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（收稿日期：2018-09-30）

（修回日期：2018-10-22;编辑：陈静）