负重爬梯与有氧跑台运动对糖尿病大鼠学习记忆能力的影响及其机制探讨*

唐 量, 亢依婷, 尹 博, 孙丽君, 樊岫珊

(陕西师范大学体育学院， 西安 710119)

负重爬梯与有氧跑台运动对糖尿病大鼠学习记忆能力的影响及其机制探讨*

唐 量, 亢依婷, 尹 博, 孙丽君, 樊岫珊△

(陕西师范大学体育学院， 西安 710119)

目的研究负重爬梯与有氧跑台运动对糖尿病大鼠学习记忆能力的改善效果并探索其可能分子机制。方法40只雄性大鼠，随机分为正常对照组(NC)、糖尿病对照组(DC)、糖尿病负重爬梯组(DL)和糖尿病有氧跑台组(DA)，以单次腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病大鼠模型。DL组在晚上进行负重爬梯训练，10次/组×3组/天，每次间歇2 min，6 天/周×6 周；DA组在同一时间进行20 m/min的跑台训练，30 min/d。于造模成功和运动干预结束后采用Morris 水迷宫检测大鼠的学习记忆能力；第2次水迷宫测试结束后断颈处死大鼠，采用 RT-QPCR法检测大鼠海马内脑源性神经营养因子(BDNF)、TRKB、CREB mRNA表达水平。结果与NC组相比，DC组大鼠海马BDNF、CREB基因表达显著下降，学习记忆能力显著降低。与DC组相比，DL和DA组大鼠海马BDNF、CREB基因表达显著上调，学习能力显著提高；DL大鼠海马TrkB基因显著上调，大鼠空间记忆能力显著改善，而DA组大鼠海马TrkB基因无显著变化，大鼠空间记忆能力无改善，与DA组相比，DL组大鼠海马TRKB、CREB基因显著上调。结论有氧跑台运动与负重爬梯运动介导BDNF/TrkB/CREB信号通路对糖尿病大鼠的学习能力均有促进作用，而负重爬梯运动对糖尿病大鼠记忆能力的改善优于有氧运动方式。

负重爬梯；有氧跑台；糖尿病；学习记忆；BDNF；大鼠

糖尿病会导致患者出现认知功能障碍，增加阿

尔茨海默病的易感性，严重影响患者的日常生活和学习工作[1]。运动可以促进脑的健康，改善大脑的学习记忆能力[2]，传统的有氧跑台运动可促进突触可塑性相关基因表达，促进学习记忆能力[3]；负重爬梯运动，作为抗阻力运动之一，是一种结合有氧和无氧的混合运动，可有效改善PS1/PS2双基因敲除所引起的学习记忆下降[4]。有氧运动与负重爬梯运动在改善糖尿病大鼠认知功能方面的效果及其作用的分子机制仍不十分清楚。本研究利用腹腔注射STZ构建I型糖尿病大鼠模型，并对糖尿病大鼠进行负重爬梯和有氧跑台运动干预，探讨负重爬梯和有氧跑台两种运动方式对糖尿病大鼠空间学习记忆能力的影响以及其与脑源性神经营养因子( brain derived neurophic factor , BDNF)/TrkB/环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein ,CREB)(BDNF/TrkB/ CREB)信号通路的关系，为运动改善糖尿病患者学习记忆能力提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

课题组自行研发爬梯装置(专利号：201020279841.8)、荧光PCR仪(美国Bio-Rad)、eBsensor耐利乐生血糖仪(台湾日章世)、STZ(美国Sigma)、 Trizol(日本Takara)、酶标仪(美国Bio-Rad)、反转录试剂盒(日本Takara)、Morris水迷宫(北京众实迪创ZS-ZS001)。

1.2 实验动物模型构建及动物分组

雄性大鼠40只(购买自西安交通大学医学院动物中心，SCXK2012-003)，8周龄，适应性饲养1周后开始实验。40只大鼠中随机选取8只大鼠为正常对照组(NC组)，其余大鼠在禁食不禁水12 h后，一次性腹腔注射65 mg/kg链脲佐菌素；NC组腹腔注射等剂量的柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH 4.5)[5]。72 h后空腹血糖值≥16.67 mol/ L视为建模成功的糖尿病大鼠[6]。剔除未成模大鼠3只，将造模成功的大鼠随机分为糖尿病对照组(DC组，n=9)、糖尿病负重爬梯运动组(DL组，n=10)和糖尿病有氧跑台运动组(DA组，n=10)。造模成功后所有大鼠进行Morris水迷宫检测，Morris水迷宫实验结束后开始运动干预。DL大鼠在晚上进行每周6天的负重爬梯训练，爬梯装置为实验室自主专利产品，训练时将大鼠置于爬梯底端，负荷量为大鼠自身体重的35%，采用尾部负重的方式进行爬梯训练[7]，每天进行3组训练，每组5次，每组间歇2 min，持续训练6周。DA组在晚上同一时间，进行每周6次的20 m/min的有氧跑台运动，每天运动30 min，持续训练六周。NC和DC组不施加任何干预。运动干预结束后，进行第2次Morris水迷宫实验。

1.3 Morris水迷宫行为测试

分别于造模成功后和运动干预结束后对所有大鼠进行Morris水迷宫测试。实验连续进行5 d，分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验在前4 天进行，空间探索实验在第5 天进行。设置程序将水桶分为4个象限，每个象限的池壁边缘中点为入水点，将平台置于第3象限中心。进行定位航行实验时，每天依次从4个象限入水点将大鼠面向池壁放入迷宫中，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，同时记录大鼠探索轨迹。如大鼠未能找到平台，将潜伏期记录为60 s，引导大鼠到达平台，在平台上停留10 s。实验第5 天，将平台撤除，进行空间探索实验，从平台对面第一象限中点将大鼠面向池壁放入迷宫中，记录大鼠在60 s内平台穿越次数，各象限滞留时间，观察大鼠的游泳轨迹。

1.4 体重、血糖的测定

分别于运动第1天、第21天、第42天使用电子天平检测大鼠的体重，在造模及运动第1天、第21天、第42天采用尾尖取血的方法检测大鼠的空腹血糖。具体操作为，将大鼠放置自制大鼠固定袋中，露出尾巴，系住封口，大鼠尾巴经酒精消毒棉球擦干后，用消毒手术剪剪去尾尖5～10 mm，然后从尾根部向尾尖按摩，血自尾尖流出。弃去第一滴血，用eBsensor耐利乐生血糖仪检测大鼠血糖。

1.5 大鼠海马样品的处理

最后一次水迷宫实验结束后大鼠禁食不禁水过夜，将大鼠断颈处死，剥离海马组织，将海马放入液氮中迅速充分冷冻后放入-80℃冰箱保存，待测RT-QPCR指标。

1.6RT-QPCR检测海马BDNF、TrkB、CREB的mRNA表达水平

用 Trizol 法提取大鼠海马内总RNA(RNA 检验A280 /A260≥1. 8 为合格)，以20 μl 反转录反应体系，通过 42℃，45 min，95℃，5 min 进行反转录反应，经反转录得到稳定的CDNA。按要求由上海生物工程股份有限公司设计合成引物，引物序列见表 1。根据SYBR试剂盒说明，配制10 μl反应体系，反应条件为95℃预变性2 min， 95℃变性10 s，50℃～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行35个循环。扩增结束后，PCR仪给出各反应孔的Ct值，以β-actin基因为内参，根据比较阈值法分析目的基因的相对表达量。

1.7 统计学处理

Tab. 1 Primer sequences of genes

2 结果

2.1 大鼠体重、空腹血糖的变化

在运动后第21天和第42天时，糖尿病大鼠体重显著低于正常大鼠(P<0.01)，与DC组相比，DL和DA组体重无显著性变化；与NC组相比，在造模后DC、DA、DL组大鼠空腹血糖显著升高(P<0.01)；在运动后第21天和第42天与NC组相比，DC组血糖显著升高(P<0.01)；与DC组相比，DL和DA组血糖显著下降(P<0.05，表2)。

Condi-tionsnWeight(g)Bloodglucose(mmol/L)D1D21 D42AftermodelingD1 D21 D42 NC8237.59±10.27349.59±16.36377.85±22.825.23±0.405.04±0.395.30±0.404.86±0.65DC9241.64±10.6525.1±33.27**242.77±32.21**17.98±3.37**19.61±3.57**19.97±5.40**22.26±3.44**DA10243.43±5.74248.71±31.69262.33±34.6217.74±1.26**18.50±2.0517.53±4.45#19.03±1.79#DL10241.2±4.62229.68±27.77257.84±17.8417.94±3.52**18.57±3.7317.93±4.07#21.36±4.39#

NC: Normal control group; DC: Diabetic control group; DA: Diabetic aerobic treadmill group; DL: Diabetic loading ladder group

**P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDC group

2.2 Morris水迷宫检测结果

2.2.1 定位航行实验结果 在第1次进行的定位航行实验中各组大鼠的逃避潜伏期之间无显著性差异。第2次实验结果显示，与NC组相比，DC组大鼠的逃避潜伏期增加，在第2天和第4天差异具有显著性(P<0.05)；与DC组相比，DL组大鼠在4 d的定位航行实验中逃避潜伏期均显著降低(P<0.05)；DA组逃避潜伏期在第2、第3和第4天时显著降低(P<0.05，表3)。从大鼠由第1象限入水的游泳路径观察，NC组和DA组大鼠寻找平台的方式以趋向式为主，DC组大鼠以随机式为主，DL组以直线式为主(图1A)。提示糖尿病大鼠逃避潜伏期显著延长，搜索平台策略不佳，负重爬梯运动和有氧跑台运动使糖尿病大鼠学习能力得到改善。负重爬梯运动和有氧跑台运动对糖尿病大鼠学习能力的改善不具有显著性差异。

2.2.2 空间探索实验结果 在第一次进行的空间探索实验中各组大鼠平台穿越次数和目标象限滞留时间比无显著性差异。第2次实验中，DC组大鼠平台穿越次数显著低于NC组大鼠(P<0.05)；DL大鼠穿越平台次数和目标象限滞留时间比显著高于DC组(P<0.05，P<0.01)；DA组和DC组及DL组间比较，无显著性差异(表3)。空间探索实验中大鼠游泳轨迹图显示：NC组和DA组大鼠搜索平台策略以随机式为主；DC组以边缘式为主； DL组大鼠游泳路径主要分布在第3，4象限，平台区域路线密集，搜索策略呈现趋向性。提示，DC组大鼠对原平台所在位置记忆模糊，DL组大鼠对原有平台位置记忆清晰，记忆能力得到改善。而DA组大鼠空间记忆能力无明显改善(图1B)。

Condi-tionsnTimeEscapelatency(S)Firstday(s)Secondday(s)Thirdday(s)Fourthday(s)PlatformcrossingsPercenttimeinthetargetquadrant(%)NC842.95±8.3441.16±7.0033.75±5.5430.38±6.131.80±0.400.24±0.09DC9After36.80±5.7232.23±1.9930.07±7.4930.23±4.421.80±0.750.23±0.03DA10modeling44.35±6.3735.82±2.5631.70±3.1230.26±6.671.75±0.430.24±0.06DL1047.63±5.1332.60±4.4834.47±6.1929.98±6.321.67±0.710.25±0.20NC828.81±1.9326.78±2.5224.90±2.4418.59±2.803.67±0.470.24±0.06DC9After34.25±1.4231.20±3.28*28.72±1.0925.65±2.34*2.25±0.43*0.20±0.08DA10exercise28.14±1.3325.96±0.76#19.49±1.03#18.53±1.53##3.33±0.470.25±0.04DL1023.24±3.89#21.96±2.62#18.96±2.75#16.91±2.65##4.25±0.43#0.31±0.04##

NC: Normal control group; DC: Diabetic control group; DA: Diabetic aerobic treadmill group; DL: Diabetic loading ladder group

*P<0.05vsNC group；#P<0.05，##P<0.01vsDC group

Fig.1Swimming track of rats in the Space exploration and Positioning navigation experiments

NC: Normal control group; DC: Diabetic control group; DA: Diabetic aerobic treadmill group; DL: Diabetic loading ladder group

2.3 大鼠海马BDNF、TrkB、CREB mRNA的表达

与NC组相比，DC组大鼠海马内BDNF、CREB基因表达显著降低(P<0.05)，TrkB 基因表达无显著性差异；与DC组相比，DL组大鼠海马内BDNF、TrkB、CREB基因表达量显著升高(P<0.01)，DA组大鼠海马内BDNF、CREB基因表达量显著升高(P<0.01)，TrkB 基因表达量无显著性差异；与DA组比较，DL组大鼠海马内TrkB、CREB基因表达量显著提高(P<0.01，图2)。

NC: Normal control group; DC: Diabetic control group; DA: Diabetic aerobic treadmill group; DL: Diabetic loading ladder group

*P<0.05vsNC group；##P<0.01vsDC group；△△P<0.01vsDAgroup

3 讨论

海马结构和功能的可塑性与学习记忆能力密切相关，糖尿病可使神经细胞存活和分化受损，诱发海马突触功能障碍，增加阿尔茨海默病的易感性[1]。BDNF与其特异性受体酪氨酸激酶B(Tyrosine Kinase B，TrkB)结合后，能够激活多条信号通路，诱导环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)磷酸化，磷酸化的CREB与CRE序列结合可启动下游靶基因的转录，促进新的蛋白合成，维持和诱导长时程增强的发生，增强突触信息传递的效能，进而促进学习和记忆能力，重要的是BDNF是含有CRE序列的CREB下游的靶基因，激活后的CREB可将BDNF的信号升级放大，进一步发挥其作用[8，10]。研究表明，糖尿病引发的学习功能障碍与脑内低表达的BDNF有关，STZ诱导的糖尿病小鼠海马CREB和BDNF基因表达下降，而脑内注射BDNF能够预防和增强β-淀粉样蛋白引起的海马长时程增强的损伤，改善阿尔兹海默症患者的学习记忆[10，12]。长期自主运动使幼龄大鼠下丘脑BDNF和pro-BDNF蛋白表达升高[13]，显著增加海马BDNF、TrkB分子的表达，而中断这种自发性运动会导致海马和大脑皮层BDNF、TrkB的长期减少[14]。运动可使大鼠海马活化的CREB增加1倍，这种增加一直会持续到运动后1周，甚至在运动后1个月才会回落到开始水平[15]。本实验研究结果表明，6周的负重爬梯运动可有效上调糖尿病大鼠海马BDNF与受体TrkB及下游效应分子CREB的基因表达，而有氧跑台运动可促进BDNF、CREB基因表达上调，对TrkB基因表达无显著性影响。

有氧运动可有效地保护心血管、改善心肺功能，而负重爬梯运动主要加强肌肉骨骼功能[5,16]。国内外诸多研究表明，运动对学习记忆能力具有促进作用[2，3, 14，15]。本实验采有氧跑台运动与负重爬梯运动作为运动干预方式，比较研究两种运动方式对改善糖尿病大鼠认知功能的效果及其作用的分子机制。结果表明，负重爬梯运动可有效改善糖尿病大鼠的学习和记忆能力，有氧跑台运动可改善糖尿病大鼠的学习能力，但对其记忆能力没有影响。可能与有氧跑台运动和负重爬梯运动对BDNF、TrkB、CREB基因表达的不同影响有关。最新研究显示，跑步运动可上调肌肉分泌因子组织蛋白酶B(CTSB)在腓肠肌和血浆中的表达，并促进成年海马神经祖细胞的BDNF基因表达，而敲除CTSB基因的小鼠进行跑台训练时，空间记忆能力无明显变化，海马神经元生成也无显著改变，表明运动对小鼠脑的认知能力可能与运动时肌肉分泌因子如CTSB的表达密切相关[17]。本课题组已报道，负重爬梯运动可抑制高脂肥胖大鼠血清及肌肉中肌肉生长抑制素Myostatin基因及蛋白表达，同时改善高脂诱发肥胖大鼠的胰岛素抵抗和脂肪堆积，增加肌肉质量以及力量[18]。据此推测，负重爬梯运动通过调节肌肉分泌相关因子的表达可能参与调节大鼠的认知功能。肌肉分泌相关因子的表达对BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响需进一步深入探讨。

综上，负重爬梯和有氧跑台运动均可显著提高糖尿病大鼠的学习能力，负重爬梯运动亦可显著改善糖尿病大鼠记忆能力，分析其机制可能与海马区BDNF分子介导的BDNF/TrkB/CREB信号通路的上调相关。建议在防治糖尿病诱发的阿尔兹海默症的运动方式中，除了有氧运动干预外，还应该考虑负重爬梯等抗阻力运动或联合运动方式以提高干预效果。

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Effectsofweight-bearingladderandaerobictreadmillexerciseonlearningandmemoryabilityofdiabeticratsanditsmechanism

TANG Liang, KANG Yi-ting, YIN Bo, SUN Li-jun, FAN Xiu-shan△

(Institutie of Physical Education, Shanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Objective: To investigate the effects of climb ladder and aerobic treadmill exercise on learning memory ability in diabetic rats and explore its possible mechanisms.MethodsForty male rats were randomly divided into normal control group (NC), diabetic control group (DC), diabetic loading ladder group (DL) and diabetic aerobic treadmill group (DA), diabetes was induced by a single intraperitoneal injection of STZ. In the evening, the DL group were trained three cycle (10 times/cycle) with weight-bearing climbing ladder, 2 min intervals, 6 days/week, lasted for six weeks. The DA group was trained on a motor-driven treadmill at a speed of 20 m/min (0 incline), 30 min/day, 6 days/week, lasted for six weeks. Morris water maze was used to detect the learning and memory ability of rats after modeling success and after exercise intervention. After the last water maze test, the rats were killed to obtain the hippocampus. RT-QPCR was used to detect the gene expressions of brain derived neurophic factor (BDNF), tropomyosin receptor kinase B (TrkB) and cAMP-response element binding protein (CREB).ResultsCompared with NC group, the expressions of BDNF and CREB gene in hippocampus of DC group and the learning and memory ability were significantly decreased. Compared with DC group, the expression of BDNF and CREB in hippocampus of DL and DA rats was significantly up-regulated and the learning ability was significantly increased. The TrkB gene of hippocampus in DL rats was significantly up-regulated and the spatial memory ability was significantly improved. Compared with the DA group, the TRKB and CREB genes in the hippocampus of DL group were significantly up-regulated.ConclusionAerobic treadmill exercise and weight-bearing ladder exercise have a positive effect on the learning ability of diabetic rats, while the weight-bearing ladder exercise improves the memory ability of diabetic rats better than aerobic exercise. These effects may be related to the up-regulation of BDNF/TrkB/CREB signaling pathway.

weight-bearing ladder exercise; aerobic treadmill exercise; diabetes; learning and memory; BDNF; rats

G804.7

A

1000-6834(2017)05-436-05

10.12047/j.cjap.5570.2017.105

国家自然科学基金项目资助(11503124)

2017-01-19

2017-06-22

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Tel： 13630287826； E-mail： xshfan@snnu.edu.cn