JAK2/STAT3信号通路在运动预适应抗心肌细胞凋亡中的作用*

孙晓娟， 冯武龙， 侯 娜

(咸阳师范学院体育学院， 陕西 咸阳 712000)

JAK2/STAT3信号通路在运动预适应抗心肌细胞凋亡中的作用*

孙晓娟△， 冯武龙， 侯 娜

(咸阳师范学院体育学院， 陕西 咸阳 712000)

目的探讨Janus激酶2-信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路在运动预适应(EP)抗心肌细胞凋亡中的作用及其机制。方法健康雄性SD大鼠80只，随机分为对照组(C组)、力竭组(EE组)、运动预适应组(EP组)、运动预适应+AG490组(EP+AG组)(n=20)。连续3 d的间歇跑台运动建立EP动物模型，力竭运动致大鼠运动性心肌损伤。采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡改变、Western blot法检测心脏Caspase-3定量表达的变化，免疫组织化学法和Western blot法显示心脏p-JAK2和p-STAT3定位和定量表达的变化。结果与C组相比，EE组心肌细胞凋亡、心脏Caspase-3、p-JAK2和p-STAT3的表达均显著升高；与EE组相比，EP组心肌细胞凋亡和心脏Caspase-3表达明显降低，而心脏p-JAK2和p-STAT3表达显著升高；与EP组相比，EP+AG组心肌细胞凋亡和心脏Caspase-3表达均显著升高，而心脏p-JAK2和p-STAT3表达明显降低。结论EP可诱导心脏磷酸化JAK2和STAT3表达增加，减少心脏Caspase-3的表达，抑制心肌细胞凋亡，提示JAK2/STAT3信号通路参与了EP抗心肌细胞凋亡的作用。

JAK2/STAT3通路；运动预适应；力竭运动；心肌细胞凋亡；大鼠

近年来，运动预适应(exercise preconditioning, EP)的心肌保护效应引起人们的关注。短暂的重复多次的较大强度运动可使心肌的缺血缺氧损伤减轻，这种通过运动致心肌相对缺血诱导机体产生心肌保护作用的现象称为EP[1]。研究证实EP能减少缺血后心肌梗死面积，促进缺血后心功能恢复，减

轻心律失常发生，同时还参与心肌细胞抗凋亡作用[2,3]，但目前关于EP心肌保护作用的机制尚不完全明确。近年研究发现Janus激酶2-信号转导子和转录激活子3(Janus kinase 2/signal transducers and activators of transcription 3, JAK2/STAT3)信号通路作为细胞内存在的重要信号转导途径之一，在细胞生长、分化、应激、增殖、凋亡等多种生理及病理生理过程中发挥重要作用[4]。较多研究表明JAK2/STAT3信号通路在缺血预适应(ischemic preconditioning, IP)和药物预适应的抗心肌细胞凋亡过程中发挥着重要作用[5,6]，而该通路是否参与EP的抗心肌细胞凋亡作用，目前尚不清楚。因此，本研究拟在EP动物模型和力竭运动致运动性心肌损伤的基础上，研究EP对心肌组织JAK2/STAT3信号通路的影响，探讨该通路在EP抗心肌细胞凋亡中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

JAK2激酶抑制剂(AG490，美国Calbiochem公司)；磷酸化JAK2(p-JAK2)抗体、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗体、Caspase-3抗体(美国Cell signaling公司)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、二步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。

1.2 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠80只，体重220～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供。大鼠进行1周的适应性饲养后，每天进行1次持续10 min的适应性跑台运动，速度为15 m/min。1周后将大鼠随机分为4组，每组20只。对照组(C组)、力竭组(EE组)、运动预适应组(EP组)、运动预适应+AG490组(EP+AG组)。建立EP动物模型，大鼠在跑台上完成连续3 d的间歇运动，运动时间为60 min/d，运动速度为28～30 m/min。在每天60 min的跑台训练中，运动15 min，休息3～5 min，重复运动3次。C组：不进行任何处理。EE组：以30 m/min的速度运动至力竭。EP组：先进行3 d 的EP，24 h后运动至力竭。EP+AG组：每天EP前10 min，腹腔注射JAK2特异性抑制剂AG490(3 mg/kg)，余处理同EP组。

1.3 样本采集

实验结束后30 min，采用0.4%戊巴比妥钠(1 ml/100 g体重)将各组大鼠腹腔麻醉后，呈仰卧位姿势固定，将每组1/2大鼠打开胸腔，摘取心脏，用预冷的灭菌生理盐水冲洗数次后，速冻于液氮中，后放置于-80℃冰箱保存，用于Western blot技术的检测。其余每组1/2大鼠进行心脏的常规灌注固定，摘取心脏，放入4%的多聚甲醛溶液中固定过夜。心脏组织经常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡和石蜡包埋，用于TUNEL法测定和免疫组化实验。

1.4 心肌细胞凋亡的测定

心肌细胞凋亡测定采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)，实验步骤按照试剂盒说明书流程进行。光学显微镜下可见凋亡心肌细胞的胞核呈棕褐色，正常心肌细胞的胞核呈蓝色。每组随机取切片5张，每张切片随机取视野5个(×400)，在光学显微镜下观察并计算心肌细胞的凋亡指数。心肌凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5 Western blot 蛋白印迹检测

称取心肌组织100 mg，加入300 μl预冷的蛋白质抽提试剂，冰上匀浆。裂解30 min后，4℃ 14 000 r/min离心15 min收集上清液。取上清液经10%SDS-PAGE凝胶电泳后转膜(PVDF膜，恒流300 mA过夜)，然后洗膜，以5% BSA溶液室温封闭1 h，加入p-JAK2(1∶2 000)、p-STAT3(1∶2 000)、Caspase-3(1∶1 000)一抗4℃孵育过夜，再次洗膜后加入HRP标记的二级抗体，室温孵育膜1 h，用KCTM化学发光系统曝光显示目的蛋白反应性条带，采用X线拍照并记录。以Image J图像分析软件对蛋白条带进行定量分析，以各组蛋白表达量与内参GAPDH比值作为结果。

1.6 免疫组织化学实验

采用SP两步法免疫组化方法。制作常规石蜡切片，切片按流程脱蜡至水；室温3% H2O2去离子水溶液孵育切片10 min；室温复合消化液孵育切片10 min；滴加一抗(兔抗p-JAK2抗体和p-STAT3抗体)，4℃孵育过夜；滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG)，37℃孵育切片20 min；DAB显色；脱水，透明，封片。Olympus显微镜下观察并拍照。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 心肌细胞凋亡染色结果

凋亡心肌细胞核呈棕褐色，正常心肌细胞核被苏木精复染呈蓝色。C组可见凋亡的心肌细胞呈散在分布(图1A)；EE组可见广泛分布的大量凋亡心肌细胞(图1B)；EP组可见少量的凋亡心肌细胞(图1C)；EP+AG组可见较多的凋亡心肌细胞(图1D)。心肌凋亡指数图像分析显示：与C组相比，各实验组心肌凋亡指数均升高(P<0.05)；与EE组相比，EP组心肌凋亡指数降低(P<0.05)；EP+AG组心肌凋亡指数较EP组升高(P<0.05, 表1)。

2.2 心脏Caspase-3蛋白表达的变化

Western blot免疫印迹结果显示：与C组相比，EE组、EP组和EP+AG组心脏Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；EP组心脏Caspase-3蛋白表达水平较EE组明显降低(P<0.05)；与EP组相比，EP+AG组心脏Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05，图2、表1)。

Fig.1Result of myocardial apoptosis staining (TUNEL ×400)

A: Control group; B: Exhaustive exercise group; C: Exercise preconditioning group; D: Exercise preconditioning + AG490 group

GroupApoptoticindexofmyocardium(%)Caspase-3expressionC9.5±2.60.142±0.052EE47.6±6.2*0.506±0.123*EP23.4±4.1*#0.287±0.069*#EP+AG36.9±5.8*△0.446±0.082*△

C: Control; EE: Exercise exhaust; EP: Exercise preconditioning; AG: Janus kinase 2(JAK2) inhibitor AG490

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsEE group;△P<0.05vsEP group

Fig.2Expression change of Caspase-3 in heart

2.3 心脏p-JAK2和p-STAT3蛋白表达的变化

免疫组织化学染色结果显示：心脏p-JAK2和p-STAT3阳性表达主要位于心肌细胞的细胞核，呈棕褐色。C组心脏p-JAK2和p-STAT3阳性表达少，可见散在分布的棕褐色细胞核(图3A、图4A)；EE组心脏p-JAK2和p-STAT3阳性表达较强，可见一定量的棕褐色细胞核(图3B、图4B)；EP组心脏p-JAK2和p-STAT3阳性表达较EE组进一步增强，可见大量的棕褐色细胞核(图3C、图4C)；EP+AG组心脏p-JAK2和p-STAT3阳性表达较EP组减少(图3D、图4D)。

Western blot免疫印迹结果显示：与C组相比，EE组、EP组和EP+AG组心脏p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平升高(P<0.05)；EP组心脏p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平又较EE组明显升高(P<0.05)；与EP组相比，EP+AG组心脏p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05，图5，表2)。

Fig.3Result of p-JAK2 immunoreactivity in heart (DAB ×400)

A: Control group; B: Exhaustive exercise group; C: Exercise preconditioning group; D: Exercise preconditioning + AG490 group

Fig.4Result of p-STAT3 immunoreactivity in heart (DAB ×400)

A: Control group; B: Exhaustive exercise group; C: Exercise preconditioning group; D: Exercise preconditioning + AG490 group

Fig.5Expression change of p-JAK2 and p-STAT3 in heart

Groupp-JAK2p-STAT3C0.149±0.0630.189±0.093EE0.294±0.085*0.304±0.118*EP0.456±0.156*#0.585±0.198*#EP+AG0.277±0.095*△0.321±0.145*△

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsEE group;△P<0.05vsEP group

3 讨论

细胞凋亡被认为是细胞死亡的一种特殊存在形式，其过程是受基因控制的主动死亡过程。研究表明力竭运动和超负荷大强度运动时，心肌细胞凋亡显著增加，且随着运动强度的加大，凋亡细胞的数目上升，细胞凋亡被认为是运动性心肌损伤发病机制中的重要环节[7,8]。而EP作为一种有效的内源性心肌保护措施，被证实能减少心肌细胞凋亡。Quindry等[9]对SD大鼠进行连续3 d的EP跑台训练，结果发现3 d运动训练可以使缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面积明显减少，TUNEL阳性细胞数量和Caspase-3表达明显减少，提示EP可通过抑制心肌Caspase-3的表达，减少心肌细胞凋亡，对心脏起到保护作用。彭峰林等[10]探讨EP对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响，结果表明高强度间歇运动和一次高强度运动都能减少缺血/再灌注心肌细胞的凋亡，影响Bcl-2和Bax的表达，使Bcl-2/Bax比值增加，说明对心肌细胞凋亡的调节是EP心肌保护的重要机制之一。本课题组[11]前期对大鼠进行连续3天的间歇跑台运动，每天以28～30 m/min的速度运动60 min，发现EP可以使大鼠心肌缺血损伤明显减轻，表明3 d的跑台训练能够促使心肌产生EP保护作用，为进一步研究JAK2/STAT3信号通路在EP抑制心肌凋亡中的机制提供实验依据。

Caspase家族是执行细胞凋亡作用的一组半胱氨酸蛋白酶，其成员Caspase-3是整个凋亡级联反应中的标志酶。Caspase-3通过对蛋白激酶、核酸酶及细胞骨架的裂解，直接使细胞发生凋亡，被认为是执行死亡蛋白酶[12]。本实验在EP动物模型和力竭运动致运动性心肌损伤的基础上，用TUNEL法检测心肌细胞凋亡改变，用Western blot方法检测心脏Caspase-3蛋白表达的变化。实验结果显示，与C组相比，EE组心肌细胞凋亡增加，同时心脏Caspase-3蛋白的表达升高，提示力竭运动诱导心肌细胞凋亡的发生。与EE组相比，EP组心肌细胞凋亡和心脏Caspase-3蛋白表达均明显下降。提示EP通过下调Caspase-3蛋白表达，减少心肌细胞凋亡，对心肌产生保护作用。

JAK/STAT信号通路是1992年发现的广泛参与细胞生长、分化、凋亡、肿瘤、免疫调节等过程，是细胞因子信号转导的重要途径。多种细胞外信号刺激引起JAKs的激活，激活的JAKs促使酪氨酸残基磷酸化，进而使STATs磷酸化而被活化，激活的STATs移位到细胞核中，启动相应的目的基因表达，发挥生物学作用[13]。研究显示JAK2/STAT3信号通路激活后可调控心肌凋亡相关因子的表达。Hattori等[14]发现IP可激活JAK2/STAT3信号通路，明显增加磷酸化JAK2、磷酸化STAT3和Bcl-2的表达，减少Bax和Caspase-3的表达，从而缩小心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡，改善缺血后的心脏收缩功能。使用JAK2特异性阻断剂AG490，能取消该通路的心肌保护作用，提示JAK2/STAT3信号通路在IP抑制心肌凋亡中起重要作用。学者们采用过氧化氢和姜黄素等药物预处理诱导大鼠的心肌保护作用[6,15]，均能诱导心肌JAK2和STAT3的磷酸化，减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡，预处理前给予JAK2抑制剂AG490后，磷酸化JAK2和STAT3表达水平下调，预适应的心肌保护效应也被抑制。综上所述，IP和药物预适应均能通过激活JAK2/STAT3信号通路，上调磷酸化JAK2和STAT3表达水平，减少心肌细胞凋亡，对心肌起保护作用。

研究表明JAK2/STAT3信号通路在IP和药物预适应的抗心肌细胞凋亡过程中起重要作用，而EP作为IP的一种特殊形式，我们认为JAK2/STAT3信号通路可能参与了EP的抗心肌细胞凋亡作用。本研究在EP动物模型的基础上，采用免疫组织化学方法和Western blot方法，对心脏中p-JAK2和p-STAT3表达进行了定位和定量研究，实验结果均一致显示，与EE组相比，EP组心脏p-JAK2和p-STAT3蛋白表达显著增加，而同时心肌细胞凋亡和心脏Caspase-3表达均明显下降。本实验在EP前给予JAK2激酶抑制剂AG490阻断下游STAT的活化，发现EP+AG组心脏p-JAK2和p-STAT3蛋白表达较EP组明显减少，而心脏Caspase-3表达和心肌细胞凋亡显著增加，提示JAK2/STAT3信号通路是Caspase-3的前提，该通路在EP抗心肌细胞凋亡中起重要调控作用。

综上所见，JAK2/STAT3信号通路参与了EP的心肌保护作用，EP通过激活JAK2/STAT3信号通路，诱导心脏磷酸化JAK2和STAT3表达增加，下调心脏Caspase-3表达，抑制心肌细胞凋亡，从而发挥预适应心肌保护作用。

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TheroleofJAK2/STAT3signalingpathwayinexercisepreconditioningagainstmyocardialapoptosis

SUN Xiao-juan1△, FENG Wu-long1, HOU Na1

(1. School of Sport, Xianyang Normal University, Xianyang 712000, China)

Objective: To study the effects of Janus kinase 2/signal transducers and activators of transcription 3 (JAK2/STAT3) in exercise preconditioning (EP) against myocardial apoptosis.MethodsEighty healthy male SD rats were randomly divided into control group(C), exercise exhaust(EE) group, EP group, and EP+JAK2 inhibitor AG490(AG) group(n=20). By using 3 days intermittent treadmill exercise, the EP animal model was established, and myocardial injury was induced by exhaustive exercise on treadmill. The changes of myocardial apoptosis were evaluated by TUNEL. The expressions of Caspase-3, p-JAK2 and p-STAT3 in heart were detected by Western blot or immunohistochemistry.ResultsCompared with group C, myocardial apoptosis, and the expressions of Caspase-3, p-JAK2, and p-STAT3 in heart were increased significantly in group EE. Compared with group EE, myocardial apoptosis and the expression of Caspase-3 were decreased significantly, while the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 were increased significantly in group EP. Compared with group EP, myocardial apoptosis and the expression of Caspase-3 were increased significantly, while the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 were decreased significantly in group EP+AG.ConclusionEP could increase the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 and decrease the expression of Caspase-3 in heart, which further mitigate myocardial apoptosis. Hence, JAK2/STAT3 pathway may participate in EP against myocardial apoptosis.

JAK2/STAT3 pathway; exercise preconditioning; exhaustive exercise; myocardial apoptosis; rat

R318

A

1000-6834(2017)05-393-05

10.12047/j.cjap.5473.2017.095

陕西省教育厅科学研究计划项目(16JK1830)；2016咸阳师范学院国家级大学生创新创业训练计划资助项目(201610722029)

2016-07-13

2017-05-17

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Tel： 15991039053； E-mail： 565489181@qq.com