Slit 2N与丝素蛋白混合物诱导大鼠海马神经元迁移的体外模型建立*

刚 琳, 李一鹏, 卢 磊, 杨 凯, 孙中磊, 陈旭义, 涂 悦△

(1. 天津中医药大学， 天津 300193； 2. 武警后勤学院附属医院脑科中心， 脑创伤与神经疾病研究所，天津市神经创伤修复重点实验室， 天津 300162； 3. 锦州医科大学， 锦州 121001)

Slit2N与丝素蛋白混合物诱导大鼠海马神经元迁移的体外模型建立*

刚 琳1,2, 李一鹏1,2, 卢 磊1,2, 杨 凯2,3, 孙中磊2,3, 陈旭义2, 涂 悦1,2△

(1. 天津中医药大学， 天津 300193； 2. 武警后勤学院附属医院脑科中心， 脑创伤与神经疾病研究所，天津市神经创伤修复重点实验室， 天津 300162； 3. 锦州医科大学， 锦州 121001)

目的利用Slit排斥导向迁移和丝素蛋白，探索建立简便可行、经济实惠、作用持久的神经元导向迁移模型新方法。方法提取SD新生鼠海马组织，以专用细胞培养片体外培养神经元，分为空白对照组、单纯丝素蛋白、单纯Slit 2N和Slit 2N与丝素蛋白混合物组(以下简称混合物组)，分别随机选择不同视野下50个神经元，用显微镜拍照记录胞体坐标及突起状态，除空白对照组外，其他3组均距每个神经元100 μm处添加相应诱导物，共观察30 min，再次记录后，用免疫荧光染色法鉴定细胞性质及其阳性率。结果单纯Slit 2N组和混合物组均可见突起向浓度低处迁移或弯曲，且长度有所缩短，空白对照组和单纯丝素蛋白组未见明显变化。突起变化的平均持续时间及平均长度差从大到小依次为混合物组、单纯Slit 2N组、单纯丝素蛋白组(P<0.05)，单纯丝素蛋白组和空白对照组间无明显变化(P>0.05)。四组神经元MAP-2阳性率均达到90%以上。结论丝素蛋白对Slit 2N诱导大鼠海马神经元迁移作用无明显影响，可有效减缓Slit 2N扩散速度，使作用时间延长，为治疗中枢神经系统疾病建立三维神经定向修复提供有利的体外实验构建基础。

Slit 2N；丝素蛋白；海马神经元；神经导向；神经迁移；神经修复；大鼠

神经系统疾病在不同程度上均会有神经连接结构的改变，其分子机制尚不明确。最新研究发现轴

突导向蛋白与此有关，它在功能或表达上发生变异后可以引起神经网络病理性改变，同时神经导向蛋白缺损还会影响心血管和免疫系统疾病，从而直接或间接导致神经系统疾病，对治疗脊髓损伤、轴索损伤、阿尔茨海默病、癫痫等神经系统疾病有非常重要的意义[1]。Slit是具有排斥作用的神经导向蛋白之一，它包含3个亚型(Slit 1，Slit 2，Slit 3)，能与Robo受体家族结合，主要在大鼠胚胎期和新生期脑隔区分布，依靠浓度梯度实现排斥性神经细胞迁移作用。有研究表明，Slit 2对海马神经元轴突有排斥及抑制生长作用，并参与神经纤维及突触形成[2]。Slit 2具有N端和C端，目前针对它的体内分子机制已逐步阐明，但体外模型构建方法依然缺乏。有研究通过高通量微流体装置检测导向蛋白浓度梯度[3]，亦有研究利用显微探针‘一面添加、一面吸出’形成浓度梯度诱导后，通过长时程同步拍摄显微镜实时记录轴突变化[4，5]。此类模型构建复杂，浓度保持时间较短，诱导物需用量大，仪器价格昂贵，不利于广泛推广。因此本研究利用丝素蛋白良好的生物相容性，与Slit 2N混合，减缓诱导物扩散速度，降低诱导物使用量，再利用微尺盖塑片，构建经济实惠、操作简单的大鼠海马神经元导向体外模型，为未来三维神经修复及Slit基因生物学功能研究提供有力的工具。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新生12 h内SD大鼠30只，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2 试剂与材料

人重组Slit 2N(Peprotech，美国)，丝素蛋白(由中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所提供)，微尺盖塑片(Cellattice，中国)，20 mmol/L pH 8.8 Tirs溶液(Sigma，美国)，150 mmol/L NaCl溶液(Sigma，美国)，兔抗大鼠MAP-2多克隆抗体(Abcam，美国)，红色标记山羊抗兔二抗(Life，美国)，磷酸盐缓冲液PBS(phosphate buffered saline，Solarbio，中国)，胎牛血清FBS(fetal bovine serum，Gibco，美国)，Neurobasal培养基(Life，美国)，DMEM/ F-12 1∶1培养基(Dulbecco's modified eagle media: nutrient mixture F-12 1∶1，Hyclone，美国)，D-hank’s缓冲液(上海培源，中国)。4%多聚甲醛溶液(Solarbio，中国)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，Solarbio，中国)，牛血清白蛋白BSA(bovine serum albumin，Sigma，美国)，多聚赖氨酸(Sigma，美国)，青霉素-链霉素双抗(以下简称双抗，Solarbio，中国)，2.5 %胰蛋白酶(Solarbio，中国)。

1.3 实验分组与诱导物配置

提取大鼠海马组织，以微尺盖塑片体外(图 1)接种神经元，培养72 h后分为4组，空白对照组不添加诱导物，单纯丝素蛋白组的诱导物为丝素蛋白，单纯Slit 2N组的诱导物为8 μg/ml Slit 2N，混合物组的诱导物为8 μg/ml Slit 2N与丝素蛋白混合物。人重组Slit 2N来源于HEK 293细胞，为神经导向研究常用药物。Slit 2N母液配制：原粉末开盖前离心，在超净台内以20 mmol/L pH 8.8 Tris+150 mmol/L NaCl缓慢溶解至1.0 mg/ml，溶解时间为2 h，分装储存于-20℃或-80℃冰箱内。稀释方法：配制时需在超净台内进行，将1.0 mg/ml Slit 2N母液以PBS稀释125倍至8 μg/ml，储存于-20℃或4℃冰箱内。Slit 2N与丝素蛋白混合物组配制：取1.0 mg/ml Slit 2N母液在超净台内，以丝素蛋白稀释125倍至8 μg/ml，储存于-20℃或4℃冰箱内。

Fig.1The physical and schematic illustration of cellatticeTMmicro-ruled plastic coverslip

1.4 原代海马神经元提取和体外培养

1.4.1 准备工作 实验前4 d，将微尺盖塑片放于一次性无菌细胞培养皿内，于75%医用乙醇中浸泡24 h。实验前3 d，在超净台内将微尺盖塑片用无菌镊轻柔移入6孔板内，紫外照射反正面各12 h。实验前2 d，将提取所用耗材、器械清洗干净后，75%医用乙醇浸泡12 h，再将PBS与之同时高温加压灭菌，烘干耗材及器械。向装有消毒杀菌后的微尺盖塑片6孔板内加入DMEM/ F-12 1:1培养基，每孔3 ml，置于37℃培养箱内孵育24 h。实验前1 d，取出6孔板于倒置相差显微镜下观察是否有污染。抛弃污染孔内培养基并作标记，更换未污染孔内培养基，继续置于培养箱内，操作中防止交叉污染。随后配制A液、B液、C液及0.025%多聚赖氨酸，均储存于4℃冰箱内备用；实验前1 d，铺板，取出6孔板置于超净台内，抛弃孔内培养基，用无菌PBS清洗2 min×3次，晾干后取0.025%多聚赖氨酸，每孔200 μl，铺于微尺盖塑片中央标尺范围内，于37℃培养箱过夜。A液：取60 ml DMEM/F-12 1:1培养基，加入1%双抗；B液：取60 ml DMEM/ F-12 1:1培养基，加入1%双抗和10%FBS；C液：取60 ml Neurobasal培养基，加入1%双抗。

1.4.2 提取步骤 取出6孔板，回收0.025%多聚赖氨酸，用无菌PBS清洗2 min×3次，加入C液，每孔3 ml，置于37℃培养箱备用。超净台及无菌操作台上摆放相应无菌器械和容器。以下所有步骤均在无菌操作台内冰上进行，注意过程中无菌操作：培养皿中放入3～4 ml A液；取一只新生鼠(图 2a，图2见彩图页Ⅰ)，放入盛有100 ml 75%医用乙醇的小烧杯中浸泡1 min，再移至装有10 ml 75%医用乙醇的培养皿中翻转消毒1 min，无菌PBS冲洗表面乙醇；将新生鼠放入空的无菌培养皿中断头(图2b)，躯体部分弃于废物盘内；左手执镊固定鼠鼻，右手从枕叶向额叶剪开皮肉(图2c)；右手换剪，继续按相同方向剪开颅骨；换用眼科镊，轻柔拨开颅骨，再用眼科剪剪开硬脑膜(图2d)；用眼科弯镊，缓慢挑出全脑(图2e)，置于装有A液的无菌培养皿中(图2a)；剥离小脑(图2f-g)，分离左右大脑半球，使其腹面朝上(图2h)；在体视解剖显微镜下剥离中脑，暴露海马组织(图2i)；继续剥取海马组织，分离包裹的血管网膜(图2j)；将海马组织放入装有1 ml D-hank’s缓冲液的1.5 ml无菌离心管中，每管最多可放4条海马组织。

1.4.3 培养操作 以下步骤均在超净台内进行，轻柔吹打时以不起泡沫为宜：将所有海马组织取出，放入装有10 ml D-hank’s缓冲液的15 ml无菌离心管内，轻柔吹洗3次，静置2 min；待海马组织全部沉淀后，吸出上清液，再加入10 ml A液轻柔吹洗3次，静置2 min，待海马组织沉淀后吸出上清液，重复2次；加入9 ml A液和1 ml 2.5 %胰蛋白酶，置于37℃培养箱内消化20 min；加入1 ml B液混匀停止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液；再滴加10 ml B液轻柔吹打1 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入5 ml B液后全部移入100 mm无菌培养皿中，培养皿倾斜30°摆放，轻柔吹打30次；经200目筛网过滤，收集于离心管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入3 ml B液，轻柔吹打至单细胞悬液计数。取出6孔板，吸出孔内培养基，重新加入B液，每孔2 ml；每孔种20～30万个细胞，最后用B液调整各孔培养基至3 ml，置于37℃培养箱内孵育4 h。镜下观察细胞是否贴壁，再于超净台内轻晃两下，吸出培养基，加入C液，每孔3 ml，继续培养72 h。

1.5 神经元迁移体外模型制备

取出6孔板内任意一孔内的微尺盖塑片，放入35 mm无菌培养皿内，加入3 ml C液，置于倒置相差显微镜下随机选取视野，寻找生长状态良好且未聚团的细胞，拍照并记录胞体坐标，再用显微注射器于距离神经元突起100 μm 处缓慢添加诱导物20 μl并持续观察30 min[4]，空白对照组不添加任何诱导物，只持续观察30 min，四组均实时对其进行连拍记录。每组分别随机选择不同视野下50个神经元进行统计、比对诱导效果持续时间及细胞突起长度变化前后差值(长度差=变化前-变化后)，随后对神经元进行MAP-2免疫荧光染色鉴定。

1.6 免疫荧光染色鉴定

将微尺盖塑片放于新的6孔板内，使用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2 min×3次；加0.5% Triton X-100的PBS透化处理20 min后吸出，PBS清洗2 min×3次；加入5%BSA封闭处理20 min后，每张微尺盖塑片滴加200 μl兔抗大鼠MAP-2多抗(用PBS以1∶200稀释)于4℃冰箱过夜。过夜后室温复苏40 min，吸出一抗，PBS清洗2 min×3次；在每张微尺盖塑片滴加200 μl红色标记山羊抗兔二抗(用PBS以1∶200稀释)，放于37℃温箱孵育30 min后吸出，PBS摇床清洗5 min×3次；用PBS以1∶100稀释DAPI后滴加于微尺盖塑片上，常温10 min，PBS摇床清洗5 min×3次；晾干后缓冲甘油封片，用倒置荧光显微镜观察细胞性质和阳性率，阳性细胞为神经元，镜下表现为红色细胞质和蓝色细胞核。染色过程动作需轻柔，防止脱片，透化处理时须静置。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 原代海马神经元体外培养

细胞开始接种时，胞体呈圆形、透亮、单个均匀悬浮状分布(图 3a)；4～5 h后细胞开始贴壁；12～24 h后细胞全部贴壁，并伸出小的突起(图 3b)；48 h后开始分化(图 3c)，胞体呈锥形或梭形，大部分细胞突起明显，末端呈膨大锥样结构，有少量神经胶质细胞；72 h后细胞呈典型神经元特征(图 3d)，胞体增大，呈梭形、锥形或多边形，核大，突起显著增长，镜下可见明显生长锥样结构，大部分细胞尚未交织成纤维网络，生长锥相互分开，说明细胞在微尺盖塑片上能够良好的生长。

2.2 细胞突起变化情况

在显微注射同剂量的诱导物后，经微尺测量细胞突起长度结果显示，单纯Slit 2N组和混合物组的细胞突起均有所缩短，且偶有突起发生弯曲迁移现象(图 4)，而单纯丝素蛋白组和空白对照组未见明显变化：细胞突起变化前后的平均长度差从大到小依次为混合物组、单纯Slit 2N组、单纯丝素蛋白组，组间差异均有统计学意义(P<0.05，表1，图4)；细胞突起变化的平均持续时间从长到短依次为混合物组、单纯Slit 2N组、单纯丝素蛋白组，组间差异均有统计学意义(P<0.05，表1，图4)。诱导观察30 min后，3组浓度均趋于稳定，与空白对照组相比，单纯Slit 2N组和混合物组的细胞突起变化前后平均长度差和平均持续时间均有明显差异，组间差异均有统计学意义(表1，图4)；但单纯丝素蛋白组与空白对照组相比，两组的细胞突起变化前后平均长度差和平均持续时间均无明显差异，组间差异均无统计学意义(表1，图4)。

Fig.3Light microscopy was used to observe hippocampal neurons culturedinvitro

a: The suspension cells in the inoculation culture were individual; b: The cells had adhered within 24 h; c: The cells had been differentiating after 48 h; d: The cells showed typical neuron characteristics after 72 h. Scale bars in the a b c of pictures are 100 μm. Scale bars in the last one is 50 μm

Tab.1Average of length difference and duration of the four groups before and after neurites changed

GroupAverageofduration(min)Averageoflengthdifference(μm)A0.03±0.160.05±0.98B0.04±0.280.46±1.62C3.76±1.03*#12.56±1.72*#D7.97±1.35*△#22.74±2.15*△#

A: Control group; B: Pure silk fibroin group; C: Pure Slit 2N group; D: Mixture group

*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;△P<0.05vsC

2.3 免疫荧光染色结果

MAP-2免疫荧光染色结果显示，空白对照组、单纯丝素蛋白组、单纯Slit 2N组和混合物组神经元阳性率分别为92%，90%，96%，94%。部分阴性细胞突起对诱导物无明显反应(图5，见彩图页Ⅰ)。

Fig.4Light microscopy was used to observe the changes of neurite induced by Slit 2N(Scale bar=50 μm)

The arrows represent the direction of the diffusion of Slit 2N, as the concentration gradient. a: The position of neurite before induction; b: It had the obvious bending after induction

3 讨 论

神经导向蛋白与网络病理性结构连接改变的神经系统疾病有关。它们在脑部发育时期发挥吸引或排斥作用，例如Slit蛋白。Slit蛋白相对分子质量约为 200 kDa，包含1个N-末端信号肽 (ss)、4个亮氨酸丰富区 (leucine-rich repeat, LRR)、几个表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF) 样重复序列、1个ALPS (agrin-laminin-perlecan-slit)结构域和1个C-末端富含半胱氨酸序列 (cysteine knot)[6]。除胚胎时期外，Slit蛋白还在神经功能建立(神经元迁移)以及成人神经系统修复中发挥作用(调控突触可塑性)。目前对Slit 2N最佳诱导浓度及最佳诱导距离尚不明确，近年来实验研究中常用浓度为4 μg/ml、8 μg/ml，以后者居多，常选诱导距离为100 μm[4,5,7,8]，因此本研究参照8 μg/ml，距离神经元突起100 μm处添加诱导物进行实验。丝素蛋白作为一种天热高分子生物材料，具有良好的生物相容性，能提供稳定的再生环境，且比胶原蛋白降解速率更慢，是近年来三维神经修复导管材料研究及开发的焦点[9]。本研究旨在利用丝素蛋白来减缓Slit 2N在培养基中的扩散速度。观察本研究中干预后四组神经突起变化平均持续时间结果发现，单纯丝素蛋白对Slit 2N扩散速率起到很好的延缓作用，从而使Slit 2N浓度梯度的排斥作用时间增加；单纯Slit 2N组中浓度梯度维持时间较短，培养基内浓度很快趋于平稳，从而形成不了诱导梯度；而单纯丝素蛋白不具有排斥作用。

有学者研究发现，Slit对神经元轴突的排斥导向作用是通过促进生长锥上的Nogo蛋白与NgR受体结合，激活RhoA(Ras homolog gene family，member A)—ROCK信号通路[10]。此通路不但与轴突伸长有关，还可能会导致生长锥崩解。还有研究表明，轴突导向蛋白是通过影响神经元生长锥内钙离子分布，从而使轴突改变运动方向，达到神经元靶向迁移的目的[7]。本研究中干预后3组神经突起平均长度差结果显示，单纯添加丝素蛋白对神经导向和迁移作用无明显影响；单纯Slit 2N组和混合物组中均表现出Slit 2N对神经突起具有排斥性作用，促使突起向浓度较低的方向移动，甚至伴有生长锥的崩塌，从而导致突起长度缩短，但因混合物组中丝素蛋白延缓了Slit 2N的作用时间，使得该组突起长度较单纯Slit 2N组又有所缩短。光镜下根据免疫荧光染色特征选取的细胞为神经元的概率较高，微尺盖塑片对大鼠海马神经元培养可行性较强，可用于测量神经元突起长度的变化。

本研究通过已知轴突导向蛋白Slit 2对神经元轴突的影响作用，结合丝素蛋白良好的生物相容性和缓释作用，在无需持续添加因子的条件下，构建出简便可行的轴突导向蛋白诱导神经元突起迁移的体外模型，解决了进行轴突定向分化等实验操作，减少了诱导药物使用量，降低了实验成本，有助于体外研究脊髓损伤、轴索损伤、阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的神经修复和再生实验。这不仅可以避免体内众多作用因素的不利影响，亦可适用于其他轴突导向蛋白家族的体外研究。本研究未来会更深入地探讨Slit 2结合丝素蛋白构建三维脊髓微导管模型的构建方法和效果研究，为中枢神经系统疾病的治疗方案提供可能。其次，研究还将面临一些挑战，如微尺盖塑片使用问题以及阿糖胞苷提高神经元纯度[11]问题-阿糖胞苷具有细胞毒性，本研究尚未添加；微尺盖塑片不能进行高温加压灭菌，会增加细胞污染风险。因此，未来需进一步探索和改进问题。

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EstablishmentofneuritismigrationmodelinducedbySlit2Nandsilkfibroinmixtureintherathippocampalneuronsinvitro

GANG Lin1,2, LI Yi-peng1,2, LU Lei1,2, YANG Kai2,3, SUN Zhong-lei2,3, CHEN Xu-yi2, TU Yue1,2△

(1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193; 2. Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair, Institute of TraumaticBrain Injury and Neurology, Neurological Department of Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese Armed Police Forces, Tianjin 300162; 3. Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China)

Objective: To explore a simply feasible and affordable method to establish neuritis migration model induced by Slit 2N and silk fibroin mixture in the rat hippocampal neuronsinvitro.MethodsNeurons were derived from SD rat hippocampal tissues and cultured with a special cell culture-plateinvitro. The cultured neurons were divided into four groups, named as control group, pure silk fibroin, pure Slit 2N and Slit 2N mixture with silk fibroin (mixture group), and 50 different neurons were randomly selected in each group. Moreover, we photographed and recorded the soma coordinate and added the silk fibroin, Slit 2N and mixture to each neurite with a distance of 100 μm, except control group. Record again after 30 min. Property and positive rate of cells were identified by immunofluorescence staining.ResultsNeurites of the pure Slit 2N group and the mixture group became shorter, and there was no significant change in the pure silk fibroin and control groups. The results showed that the average duration and length difference before and after changed were in descending order of mixture group, Slit 2N group, silk fibroin group (P<0.05), and the silk fibroin and control groups were no significant change (P>0.05). The positive rate of MAP-2 in four groups was more than 90%.ConclusionThere were no significant effects of Silk fibroin on induced by Slit 2N in rat hippocampal neuron migration. It had an effect on reducing Slit 2N diffusion rate and extending its working time. It provides an advantageous construction methodinvitroon based 3D directed neural repair for the treatment of central nervous system diseases.

Slit 2N; silk fibroin; hippocampal neuron; neural guidance; neural migration; nerve repair; rat

Q2-33

A

1000-6834(2017)05-445-05

10.12047/j.cjap.5563.2017.107

国家自然科学基金青年项目(11102235)；天津市科技支撑计划重点项目(14ZCZDGX00500)；天津市卫生局科技基金项目(2013KZ134，2014KZ135)

2017-02-04

2017-04-27

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Tel： 13821380288； E-mail: ytumail@vip.126.com