儿童患者下呼吸道标本苛养菌阳性分离率的影响因素分析

潘 芬， 赵婉彤， 张天栋， 石迎迎， 蒋 婕， 张 泓

儿童患者下呼吸道标本苛养菌阳性分离率的影响因素分析

潘 芬， 赵婉彤， 张天栋， 石迎迎， 蒋 婕， 张 泓

目的分析儿童患者下呼吸道标本苛养菌（肺炎链球菌和流感嗜血杆菌）阳性分离率的影响因素。方法选取210份下呼吸道标本，分别在采集后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h接种于血平皿和巧克力平皿，研究运送时间、运送培养基和不同接种培养基对苛养菌阳性分离率的影响。结果200份合格下呼吸道标本研究结果显示：随着标本放置时间的增加，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌阳性分离率呈现下降趋势，除0.5 h、2 h时间段外结果差异具有统计学意义（P＜0.05），但0.5 h、2 h 2个时间段样本阳性率无差异；含半固体培养基的阳性分离率在不同时间段均高于其他2种运送培养基，但差异并无统计学意义（P＞0.05）；肺炎链球菌和流感嗜血杆菌在两种商品化平皿中阳性分离率、生长情况差别不大（P＞0.05）。结论选择合适的运送时间、运送培养基和接种培养基对于提高苛养菌阳性分离率具有一定的意义。

下呼吸道； 苛养菌； 阳性分离率

Abstract: ObjectiveTo investigate the factors affecting the isolation of fastidious bacteria such asStreptococcus pneumoniaeandHaemophilus in fl uenzaefrom lower respiratory tract specimens in children.MethodsA total of 210 lower respiratory tract specimens from children were collected and inoculated on both blood agar plate and chocolate agar plate 0.5 h, 2 h, 6 h, 12 h,and 24 h after collection. The effect of specimen turnaround time, transport medium, and inoculation medium on the isolation of fastidious bacteria was studied.ResultsThe results of 200 quali fi ed specimens showed that the isolation ofS. pneumoniaeandH. in fl uenzaesigni fi cantly decreased with the increasing of specimen turnaround time (P＜0.05), but no signi fi cant difference was observed between 0.5 h and 2 h timepoints. The isolation of fastidious bacteria in semi-solid medium was non-signi fi cantly higher than the other two transport medium (P＞0.05). No signi fi cant difference was found in the isolation and growth ofS. pneumoniaeandH. in fl uenzaeon different inoculation media (P＞0.05).ConclusionsThe appropriate specimen turnaround time, transport medium,and inoculation medium are important for improving the isolation of fastidious bacteria from lower respiratory tract in children.

Key words:lower respiratory tract; fastidious bacterium; isolation

肺炎链球菌和流感嗜血杆菌是引起下呼吸道感染（low respiratory tract infections， LRTI）的常见苛养菌，阳性分离率为20%～60%[1-3]。下呼吸道标本病原菌的分离和鉴定是诊断下呼吸道感染的金标准[4]。及时快速有效分离苛养菌是治疗LRTI的主要措施之一。

由于各实验室的人员和技术的差异，引起不同医院之间报道的LRTI苛氧菌阳性分离率高低不同[5-6]，从而影响了肺部感染病原菌的诊断，造成抗菌药物的不合理使用，延迟了临床上患儿的治疗时机。基于本实验室较高的苛养菌阳性分离率，本研究将对下呼吸道标本流程所涉及的技术要素进行评估，分别从标本分析前、分析中进行逐步规范化分析，建立并评估下呼吸道苛养菌分离的规范流程，以期提高下呼吸道标本的采集合格率、及时送检率及苛养菌准确分离率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象 收集我院2016年10－12月210例疑似下呼吸道感染患儿的下呼吸道标本210份。

1.1.2试剂与仪器 无菌棉拭子、常规三通管、含半固体培养基运送培养基、血平皿（上海伊华生物有限公司、Thermo生物有限公司）、含万古霉素的巧克力平皿（上海伊华生物有限公司、Thermo生物有限公司）、肺炎链球菌临床菌株、流感嗜血杆菌临床菌株、质控菌株（肺炎链球菌ATCC49619和流感嗜血杆菌ATCC49766）、一次性100 μL定量接种环（上海远慕生物有限公司）、VITEK 2-Compact自动鉴定仪（法国梅里埃生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1下呼吸道标本采集 临床微生物操作人员采用气管插管结合负压吸引方法[7]对210例患儿进行痰液标本采集，采集过程均严格按照无菌操作进行，每份标本均置于无菌棉拭子、常规三通管、含半固体培养基运送培养基。

1.2.2分析前评估（评估下呼吸道标本数210份）

1.2.2.1标本质量判断[8]① 肉眼观察下呼吸道标本，标本形态：“水状”、“黏液状”、“脓性”、“含血丝”、“全为血状”，记录标本性状；② 涂片镜检：低倍显微镜下，痰液涂片白细胞＞25个，上皮细胞＜10个，为合格标本；③ 计算送检下呼吸道标本的合格率：合格率=合格标本数/送检标本总数；

1.2.2.2评估标本运送时间、运送培养基对苛养菌阳性分离率的影响 ① 将无菌棉拭子、常规三通管、含半固体培养基运送培养基的每份痰液标本，分别于采集后0.5、2、6、12和24 h接种于不同血平皿和巧克力培养基中；②将接种的平皿置于37 ℃，5% CO2条件下，孵育18～24 h，观察菌落形态，对疑似为苛养菌菌落（肺炎链球菌、流感嗜血杆菌）进行纯分，纯分后的菌落经VITEK 2-Compact自动鉴定仪鉴定，确定菌种；③ 最后计算下呼吸道标本苛养菌阳性检出率：苛养菌检出率=标本苛养菌阳性数/合格标本数，评价标本运送时间、运送培养基对苛养菌阳性分离率的影响。

1.2.3分析中评估（评估上述肺炎链球菌和流感嗜血杆菌在不同商品化培养基的生长状况）① 分别选择2种商品化培养基（肺炎链球菌用血平皿、流感嗜血杆菌用巧克力平皿）；② 将下呼吸道标本分离阳性菌株配置成0.5麦氏单位菌悬液（相当于1.5×108cfu/mL），在0、24、48 h 3个时间段分别准备1支含半固体培养基塑料管，用微量加样枪吸取10 μL菌悬液加入各拭子中。将24、48 h的拭子插入配备的含有半固体培养基的塑料管中，使拭子完全包含在半固体培养基的内部，置于室温；③将0 h的各拭子立即放入装有1 mL无菌0.9%NaCl溶液的试管中，漩涡振荡30 s，在管壁上尽量挤干拭子，丢弃拭子。吸取100 μL洗脱液加入装有0.9% NaCl溶液0.9 mL的试管中，做5个10倍浓度稀释；④每个稀释度取100 μL液体加入相应的培养皿表面，均匀涂抹，置于37 ℃，5% CO2条件下，培养24～48 h；⑤ 取菌落数在30～300个的培养皿作菌落计数，算出每个稀释度的平均菌落数，从而计算出0、24、48 h 3个时间段各细菌的平均菌落数，以0 h的平均菌落数为100%带菌量，算出24、48 h各菌种的存活百分率；⑥ 在选中的培养皿中分别选出最大的5个单个菌落，用游标卡尺进行测量最大菌落的直径，并统计平均菌落的直径；⑦ 对2种商品化血平皿中肺炎链球菌α 溶血的情况进行评价；⑧质控：测定过程中所有操作均严格按照实验室室内质量控制文件进行。试验开始前，按照说明书选择相应标准质控菌株。对2种商品化血平皿进行质量控制，质量可控才可将测定数据纳入研究。

1.2.4统计学分析 采用SPPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料采用行×列卡方检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 分析前评估实验结果

2.1.1标本合格情况 本实验共采集了210份痰液标本，根据标本性状，可分为“水状”10份、“黏液状”112份、“脓性”70份、“含血丝”18份；显微镜镜检合格标本有200份，标本合格率达95.2%。200份合格痰液标本中，共检测到肺炎链球菌78株，流感嗜血杆菌30株，其中5份标本同时检测出肺炎链球菌和流感嗜血杆菌。

2.1.2运送时间对苛养菌阳性检出率的影响 200份合格痰液标本在0.5 h、2 h、6 h、12 h和24 h 5个时间段的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌阳性分离率见表1、表2，结果表明随着标本放置时间的不断延长，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌菌落数量不断减少（4+→1+/-），阳性分离率呈现下降趋势，结果差异有统计学意义（P＜0.05），但0.5 h、2 h两个时间段标本阳性率并无差异。

2.1.3运送培养基对苛养菌阳性分离率的影响 200份合格痰液标本在3种运送培养基（无菌棉拭子、常规三通管和含半固体运送培养基）的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌阳性分离率见表1、表2，结果发现含半固体培养基的阳性分离率在不同时间段均高于其他2种运送培养基，然结果差异并无统计学意义（P＞0.05）。但是，为保证2种苛养菌的阳性分离率，建议可常规采用含半固体运送培养基，尤其在标本未能及时接种的情况下。

表1 标本运送时间和运送培养基对肺炎链球菌阳性分离率的影响Table 1 The effect of specimen turnaround time and transport medium on isolation ofStreptococcus pneumoniaefrom lower respiratory tract

表2 标本运送时间和运送培养基对流感嗜血杆菌阳性分离率的影响Table 2 The effect of specimen turnaround time and transport medium on isolation ofHaemophilus in fl uenzaefrom lower respiratory tract

2.2 分析中评估实验结果

2.2.1不同培养基对苛养菌检出率的影响 在不同时间段，肺炎链球菌在2种商品化血平皿中阳性分离率差别不大（P＞0.05），同时流感嗜血杆菌在不同商品化巧克力平皿上检出率也并无明显差异（P＞0.05），提示肺炎链球菌和流感嗜血杆菌在不同厂家的血平皿、巧克力平皿阳性分离率均较为相似，不同厂家血平皿和巧克力平皿对2种苛养

菌的阳性分离率影响较小。见表1、表2。

2.2.2不同培养基对苛养菌生长情况的影响 肺炎链球菌在不同培养基的菌落大小存在一定差异；在菌落数量、细菌存活率和溶血性能方面差异不大；而流感嗜血杆菌不同培养基的菌落数量、大小、细菌存活率方面并无明显差异（P＞0.05），见表3。

表3 不同培养基对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌生长情况的影响Table 3 Effect of different inoculation media on the growth ofStreptococcus pneumoniaeandHaemophilus in fl uenzae

3 讨论

合格的下呼吸道标本是诊断下呼吸道感染的重要前提之一，临床常规采用的取材方法有咯痰法、负压吸痰法、支气管肺泡灌洗液取材等方法[7，9]，由于儿童人群无法自主咯痰，且经口咯痰易被口腔定植菌污染，其可靠性及敏感性均不如其他方法；支气管镜肺泡灌洗液有一定的指征，虽能提高病原菌的检出率，但操作较负压吸痰法为烦琐，因此临床一般建议采用负压吸痰法以获得下呼吸道标本。

影响LRTI细菌检出率的主要因素包括实验人员的技术操作、标本运送时间、运送培养基、培养平皿的选择等。本研究针对分析前影响因素进行分析：①实验技术人员操作。本研究均采用统一化培训方式，遵循实验室操作规程，并由同一名微生物检验人员操作，减少人员之间的差异性，以确保下呼吸道标本的合格率，保证苛养菌的分离。②标本运送时间。上述结果发现随着运送时间的增加，苛养菌（肺炎链球菌和流感嗜血杆菌）检出率逐渐减低，这提示下呼吸道标本需在标本采集后2 h内送至实验室并完成接种；若2 h内无法完成接种，建议冰箱保存6 h，否则会影响苛养菌的检出率。③标本运送培养基。根据实验采用的3种运送培养基进行分析，发现含半固体培养基的运送系统检出率明显高于其他运送管，有研究数据表明含半固体培养基的运送系统由1支无菌纤维拭子和含有能维持细菌生物活性的半固体培养基的塑料管组成，培养基能为插入其中的标本提供氧分和水分，防止标本干燥，保证标本中的细菌存活[10]。对于营养要求不高的细菌，还起到增殖作用，使标本能够较长时间保存。

此外，除了分析前的几个因素外，分析中的因素对于苛养菌的分离培养也起到一定的作用。分析中影响因素包括：①培养平皿的选择。肺炎链球菌一般采用哥伦比亚血琼脂平皿分离。由于流感嗜血杆菌营养条件要求较高，一般采用巧克力平皿进行分离。②苛养菌的典型形态。不同来源的同一琼脂平皿，由于其营养成分含量不同，使得细菌形态存在一定的差异。典型肺炎链球菌菌落形态呈现小、湿润、隆起、灰白色、草绿色溶血，注意与链球菌属其他细菌进行区分，以免遗漏，影响细菌阳性分离率。典型流感嗜血杆菌菌落形态呈无色透明、不溶血、呈露滴状小菌落，注意与奈瑟菌鉴别。③实验室检测人员的检测能力。实验室操作人员均具有微生物多年检测经验，能确保上述苛养菌的准确分离及鉴定。本研究结果显示2种商品化培养基的苛养菌阳性分离率差别不大（P＞0.05），但是由于培养基含水量的不同，使得菌落大小存在一定的差异，这就需要考验实验室检测人员的经验水平。在苛养菌菌株分离过程中，需结合其他生化试验辅助鉴定该菌株，以防漏检。

因此，在下呼吸道标本采集、分离培养及鉴定的过程中，做好分析前、分析中两大方面的规范操作，确保标本准备采集、及时接种和准确鉴定，对于提高苛养菌的检出率具有一定的意义，为临床上有效治疗儿童下呼吸道苛养菌感染提供有力支持，进而降低儿童下呼吸道苛养菌的感染率。

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Factors affecting the isolation of fastidious bacteria from lower respiratory tract specimens in children

PAN Fen, ZHAO Wantong, ZHANG Tiandong, SHI Yingying, JIANG Jie, ZHANG Hong. （Department of Laboratory Medicine, Shanghai Children's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040, China）

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0541-05

10.16718/j.1009-7708.2017.05.011

2017-03-03

2017-03-30

上海申康医院发展中心市级医院临床辅助科室能力建设项目（SHDC22014012）；上海市卫计委重要薄弱学科建设（2015ZB0203）。

上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院检验科，上海 200040。

潘芬（1988—），女，硕士，检验技师，主要从事细菌耐药机制及传播机制研究。

张泓，E-mail：zhanghong3010@126.com。