产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌整合子和插入序列共同区1检测及分型

杜 娜， 卯 建， 刘淑敏， 牛 敏， 尧 静， 张孟爽， 杜 艳

产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌整合子和插入序列共同区1检测及分型

杜 娜， 卯 建， 刘淑敏， 牛 敏， 尧 静， 张孟爽， 杜 艳

目的研究临床分离产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌中整合子和插入序列共同区1（ISCR1）移动元件的分布和携带耐药基因盒情况，以及菌株的同源性。方法收集昆明医科大学第一附属医院2012年6月－2014年10月产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌18株，采用VITEK 2全自动药敏鉴定仪进行菌种鉴定和药敏试验； PCR及测序法检测Ⅰ～Ⅲ类整合酶基因和ISCR1元件保守区，以及可变区携带的耐药基因盒；采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对菌株进行分型研究。结果检测菌株中77.8%（14/18）菌株Ⅰ类整合子保守区阳性，27.8%（5/18）菌株ISCR1元件保守区阳性，未检测到Ⅱ、Ⅲ类整合子；72.2%（13/18）菌株Ⅰ类整合子可变区阳性，未检测到ISCR1元件的可变区；整合子可变区含有编码对氨基糖苷类抗生素耐药的基因盒（aadA1、aadA5、aac（6'）-Ib-cr）和编码对磺胺类抗菌药物耐药的基因盒（dfrA、dfrA15、dfrA17），可变区基因盒未检测到NDM-1耐药基因；PFGE分型将18株菌分成17种型。结论产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌克隆播散趋势不明显，Ⅰ类整合子广泛存在于此类菌中，ISCR1元件携带率较低，并且这两类移动元件与我院NDM-1基因的传播无关。

整合子； 插入序列共同区1； 产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌； 克隆传播

Abstract: ObjectiveTo investigate the distribution of integrons and ISCR1 elements in NDM-1-producingCitrobacter freundiiisolates, and analyze the genotypes of these strains to understand their homology.MethodsA total of 18 strains of NDM-1-producingCitrobacter freundiiwere collected from the First Af fi liated Hospital of Kunming Medical University during the period from June 2012 and October 2014. The isolates were identi fi ed and subjected to antimicrobial susceptibility testing with VITEK 2 System. Class I, II, and III integrons and ISCR1 elements were detected by PCR. Clonal relatedness was assessed by pulsedfi eld gel electrophoresis (PFGE).ResultsMost (77.8%, 14/18) strains were positive for class I integron conserved region, 27.8%(5/18) isolates were positive for ISCR1 conserved region. No class II or III integron was detected. Most (72.2%, 13/18) isolates were positive for class I integron variable region. None of the strains harbored class II integron or ISCR1 variable region. Integron variable regions included gene cassette encoding resistance to aminoglycosides (aadA1,aadA5,aac(6’)-Ib-cr) and trimethoprim-sulfamethoxazole (dfrA,dfrA15,dfrA17). PFGE revealed 17 clusters among 18 NDM-1-producingCitrobacter freundiiisolates.ConclusionsThe clonal dissemination of NDM-1-producingCitrobacter freundiiisolates is not signi fi cant. Class I integron is prevalent in NDM-1-producingCitrobacter freundii. The presence of ISCR1 is relatively rare. The two mobile elements are not related to the spread ofNDM-1 gene in this hospital.

Key words:integron; insertion sequence common region-1; NDM-1-producingCitrobacter freundii; clonal dissemination

弗劳地枸橼酸杆菌属肠杆菌科细菌，是重要的医院感染病原菌，可引起腹泻、脑膜炎、尿路感染、呼吸道感染和血流感染[1]。碳青霉烯类抗生素如亚胺培南和美罗培南等是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBL）和产AmpC酶肠杆菌科细菌引起感染的最后一道防线，但是，随着该类抗生素的大量使用，该防线已经被各种产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌突破，严重地限制了临床用药选择。细菌可产生新德里金属β内酰胺酶-1（New Delhi metallo-beta-lactamase1，NDM-1）会对除单环酰胺类抗生素外的几乎所有抗生素都耐药[2]。耐药基因的水平转移是细菌耐药性快速播散的原因之一，整合子和插入序列共同区（insertion sequence common region， ISCR）元件是耐药基因水平转移的重要元件。本研究拟通过对18株产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌进行整合子和ISCR1元件的检测，明确耐药基因盒的携带情况，通过脉冲场凝胶电泳（pulsed fi eld gel electrophoresis，PFGE）分型研究，明确克隆播散趋势。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集昆明医科大学第一附属医院2012年6月－2014年10月产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌18株，在本课题前期研究中采用改良的Hodge试验、金属酶（MBL）表型确证试验以及PCR法检测NDM-1，通过VITEK 2进行菌株鉴定。菌株来源于尿液标本，集中在移植中心（12株），干疗科（3株），泌尿外科（1株），神经外科（1株），中医科（1株）。沙门菌H9812菌株由俞云松教授惠赠，质控菌大肠埃希菌ATCC25922由本科室保存。

1.1.2 试剂 聚合酶链反应（PCR）所用试剂及5×TBE（TIANGEN公司），低熔点胶和AgaroseⅢ胶（上海生工公司），蛋白酶K（美国Sigma公司），XbaⅠ内切酶（美国Promega公司）。

1.1.3 仪器 VITEK 2全自动微生物鉴定及药敏分析仪及配套GN、GN14板卡（法国生物梅里埃公司），CO2培养箱（昆明友宁科技公司），1G603二级生物安全柜（美国Baker公司），SW-CJ-1 F超净工作台（中国 苏州净化设备公司），MyCycler TM thermalCycler DNA扩增仪、Power Pac3000型电泳仪、CHEF Mapper XA脉冲场凝胶电泳系统、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），紫外分光光度计（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1药敏试验 采用VITEK 2系统进行菌种鉴定及药敏试验。通过纸片扩散法复核细菌对亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、甲氧苄啶-磺胺甲唑和阿米卡星的药敏结果。药敏结果的判读参照2014年CLSI M100-S24标准。

1.2.2PCR法检测整合子和ISCR1元件的保守区和可变区 煮沸法提取细菌基因组DNA，PCR法扩增Ⅰ～Ⅲ类整合子和ISCR1元件的保守区及Ⅰ类整合子和ISCR1的可变区，引物见表1[3-6]。反应总体系为 25 μL ：DNA 模板 1 μL，2×TaqPCR Master MIX 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL。Ⅰ～Ⅲ整合酶基因扩增条件为：95 ℃5 min ；94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 个循环； 72 ℃ 10 min； ISCR1元件的保守区扩增的退火温度为55 ℃，其余条件同整合子。Ⅰ类整合子可变区基因扩增条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，35 个循环 ；72 ℃10 min； ISCR1元件的可变区扩增条件为：95 ℃5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果显示阳性时将扩增产物送往北京诺赛基因公司进行测序分析。

1.2.3PFGE分型 对产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌进行PFGE分子分型。取在MH平皿上纯培养后的细菌调配菌液，紫外分光光度计测得的590 nm处吸光度值（D）0.8～1.0为宜[7]，将菌液与2%低熔点胶以1∶1比例进行细菌的包埋，再经过蛋白酶K消化及内切酶XbaⅠ酶切，最后PFGE电泳条件：6 V/cm，初始转换时间为5 s，最终转换时间为40 s，14 ℃，电场角度120°，0.5×TBE，总时间22 h；PFGE条带的判读参照Tenovel等[8]提出的标准。PFGE所用标志物为沙门菌Braenderup血清型H9812菌株经XbaⅠ内切酶酶切后产物[9]。

表1 整合子和ISCR1扩增引物Table 1 The primers for amplifying integrons and insertion sequence common region 1

2 结果

2.1 药敏结果

18株菌对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类抗生素的耐药率高达100%，对氨曲南、庆大霉素、甲氧苄啶-磺胺甲 唑、环丙沙星、四环素、左氧氟沙星和呋喃妥因耐药率分别为66.7%、66.7%、66.7%、61.1%、61.1%、33.3%和11.1%。

2.2 整合子和ISCR1元件保守区及可变区检测结果

77.8 %（14/18）的菌株Ⅰ类整合子保守区阳性，27.8%（5/18）的菌株ISCR1元件保守区阳性，未检测到Ⅱ类、Ⅲ类整合子。72.2%（13/18）的菌株Ⅰ类整合子可变区阳性，未检测到ISCR1元件的可变区；测序后经BLAST对比发现整合子可变区含有编码对氨基糖苷类抗生素耐药的基因 盒（aadA1、aadA5、aac（6'）-Ib-cr） 和 编 码对磺胺类抗菌药物耐药的基因盒（dfrA、dfrA15、dfrA17），基因盒的排列为：dfrA-aadA1， aac（6’）-Ib-cr，dfrA15，aadA1，dfrA17-aadA5，可变区基因盒未检测到NDM-1耐药基因。

2.3 PFGE分型结果

PFGE分型将18株菌分成17种型，其中有2株（10和12）为同一型，其余菌株各成一型，表明这些菌株克隆传播趋势不明显，见图1。

图1 部分菌株脉冲场凝胶电泳图Figure 1 Pulsed- fi eld gel electrophoresis of XbaI-digested DNA of selectedCitrobacter freundiiisolates

3 讨论

弗劳地枸橼酸杆菌是医院获得性感染常见的革兰阴性杆菌之一，由于其固有产头孢菌素酶的特性，对临床常用抗感染药物如广谱β 内酰胺类抗菌药物耐药，但对碳青霉烯类药物仍保持敏感。随着碳青霉烯类抗生素的大量使用，临床上出现了碳青霉烯类耐药弗劳地枸橼酸杆菌。本课题前期对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌进行耐药机制研究，发现了18株产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌，为进一步了解其传播规律，我们对其进行整合子及ISCR1元件的检测，并分析了其克隆传播趋势。

药敏结果显示菌株对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等抗菌药物均高度耐药，但是对阿米卡星仍保持敏感，与之前报道不相符[10-11]。随后我们采用纸片扩散法对阿米卡星的药敏结果进行复核，发现2种方法呈现的药敏结果相同。Wang等[12]对产NDM-1肺炎克雷伯菌进行耐药性的检测发现其对所有β 内酰胺类抗生素均耐药，但是对阿米卡星敏感，与我们的报道相符。

碳青霉烯类耐药基因得以快速传播的原因之一在于它们可以以整合子和ISCR1等移动元件为载体，在同种或不同种细菌间传播[13]。本研究在77.8%（14/18）产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌中检出Ⅰ类整合子，可见Ⅰ类整合子在产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌中分布广泛。Ⅰ类整合子的可变区阳性率为72.2%，测序后经BLAST比对发现整合子可变区含有编码对氨基糖苷类抗生素耐药的基因盒（aadA1、aadA5、aac（6'）-Ib-cr）和编码对磺胺类耐药的基因盒（dfrA、dfrA15、dfrA17），未检测到NDM-1耐药基因，这表明整合子参与细菌多重耐药的形成，但NDM-1基因可能位于其他传播元件上如质粒和转座子等。

产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌具有多重耐药性以及NDM-1基因的传播性，因此，对该种菌进行分型具有重要的分子流行病学意义。本研究采用PFGE分型方法对产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌进行分型发现18株菌株可被分为17型，这表明我院产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌克隆流行趋势不明显，但是其中有2株属于同一型，为防止其大范围的克隆播散，应积极监测该型克隆株。

尽管我们在整合子及ISCR1元件中未发现NDM-1基因，但是发现了编码对氨基糖苷类和磺胺类抗菌药物的耐药基因盒，可见，整合子在细菌多重耐药和耐药传播中发挥着重要作用。因此，积极研究临床分离菌株中整合子和基因盒的种类及结构，对了解细菌耐药进而控制细菌耐药有着重要意义。此外，产NDM-1弗劳地枸橼酸杆菌潜在的克隆流行株应引起我们的高度重视。

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Detection of integrons and ISCR1 in and genotyping of NDM-1-producing Citrobacter freundii

DU Na, MAO Jian, LIU Shumin, NIU Min, YAO Jing, ZHANG Mengshuang, DU Yan. （Department of Laboratory Medicine, the First Af filiated Hospital of Kunming Medical University, Yunnan Institute of Laboratory Diagnosis, Yunnan Key Laboratory of Laboratory Medicine, Kunming 650032, China）

R378.2

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0523-04

10.16718/j.1009-7708.2017.05.007

2017-02-10

2017-03-30

云南省医疗卫生单位内设研究机构科研项目（2016NS030）；昆明医科大学研究生创新基金（2016570）。

昆明医科大学第一附属医院检验科，云南省实验诊断研究所，云南省检验医学重点实验室，昆明 650032。

杜娜（1989—），女，硕士研究生，从事细菌耐药基因传播机制研究。

杜艳，E-mail：duyan_m@139.com。