多酚氧化酶抑制剂高良姜素抗黑色素瘤机制研究①

杨镓宁 邓 菲 潘 宁

(四川省医学科学院四川省人民医院皮肤外科,成都610072)

多酚氧化酶抑制剂高良姜素抗黑色素瘤机制研究①

杨镓宁 邓 菲②潘 宁

(四川省医学科学院四川省人民医院皮肤外科,成都610072)

目的：研究高良姜素对多酚氧化酶(PPO)的抑制作用机制，并探讨了高良姜素与多酚氧化酶的结合机制，以期获得高良姜素抗人恶性黑色素瘤细胞株A375机理。方法：分光光度法检测高良姜素对PPO的抑制作用和抑制作用类型；荧光光谱法和分子对接法检测高良姜素与PPO酶的结合方式；MTT法测定高良姜素人恶性黑色素瘤细胞株A375增殖的抑制作用，Transwell法检测高良姜素对A375细胞侵袭的抑制作用。结果：高良姜素是一种竞争型的PPO抑制剂，对PPO氧化酶的半抑制率IC50为 (47.86±3.33) μmol/L，抑制常数Ki为 (24.83±1.45) μmol/L；高良姜素能够有效猝灭PPO的荧光，高良姜素与PPO的结合常数Ka为(4.67±0.43) × 104L/mol；高良姜素能够与PPO的活性中心铜离子发生结合作用，并与催化基团His259形成氢键；高良姜素能够明显的抑制A375细胞的增殖和转移，且细胞中的PPO活性和黑色素的合成量降低。结论：高良姜素是一个竞争性的PPO酶抑制剂，对调节黑色素水平起到重要作用，为临床抗皮肤癌提供了理论基础。

高良姜素；多酚氧化酶；抑制作用；荧光光谱；螯合金属铜离子；人恶性黑色素瘤细胞株A375；凋亡

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO) 在生物学上又叫酪氨酸酶，它是由多亚基的含铜氧化物组成的还原酶[1]，多酚氧化酶同时具有单酚酶和二酚酶两种活性特征，在人体内催化黑色素合成起到重要的作用，与人的衰老和皮肤癌变有密切关系[2，3]，这是由于当人体的含氧自由基大量存在时，会诱导PPO的活性过度表达，加快了黑色素的合成速率，使黑色素大量的积累，这容易引发黑色素瘤等发生，因此以PPO为作用靶点，通过对活性过度表达PPO的抑制效应，能够成为治疗黑色素瘤等皮肤疾病的一条重要途径。很多PPO抑制剂是通过化学合成得到的，对人体有一定的毒副作用，因此筛选出天然和安全的PPO抑制剂是迫切需要的，Xie等[4]报道了多种黄酮的类化合物能够对PPO的活性产生抑制作用，而高良姜素结构式为3,5,7-三羟基黄酮 (如图1所示)，属于黄酮醇类的化合物，是从高良姜的根茎和蜂胶等植物中提取分离得到[5-8]，其具有抗氧化、止呕、镇痛和抑制离体肠运动的作用[9]，此外Zhang等[10]研究了高良姜素通过体内抑制降低黏着斑激酶表达对B16F10黑色素瘤细胞生长和转移具有抑制作用，但并未通过以PPO作为抑制对象，对人恶性黑色素瘤细胞株A375的增殖和转移进行研究。由此，本工作以PPO为作用靶点，以高良姜素为研究对象，获取高良姜素对PPO的抑制机理，为高良姜素对人恶性黑色素瘤细胞株A375生长的抑制作用提供理论基础。

图1 高良姜素的分子结构式Fig.1 Molecular structure of galangin

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人恶性黑色素瘤细胞株A375为本实验所选用的细胞株， 购自上海中科院细胞生化所，在本实验室进行培养。

1.1.2 药物与试剂 高良姜素、曲酸、左旋多巴(L-DOPA，分析纯)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，高良姜素用pH6.8的磷酸盐缓冲液分别配置浓度为1 000 μmol/L储备液；多酚氧化酶购自Sigma-aldrich(上海)贸易有限公司。

1.1.3 仪器 酸度计(pHS-3C)购自上海雷磁仪器厂；紫外-可见分光光度计(UV-2450)购自日本岛津公司；荧光光度计(F-7000)购自日立(中国)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PPO的活性测定 在pH6.8的磷酸盐缓冲体系中下，把高良姜素和PPO混合37℃下孵化3 h后，加入底物L-DOPA，运用分光光度法(动力学软件)测定475 nmOD变化值[11]，计算酶相对活性(%)=(药物体系下OD值/空白OD值)×100%，曲酸为阳性对照。

1.2.2 PPO抑制动力学研究 在pH6.8的磷酸盐缓冲体系中下，固定PPO的浓度，检测酶促反应速度与底物浓度的关系，采用Lineweaver-Burk作图，计算高良姜素对PPO的抑制常数Ki。

1.2.3 PPO的荧光光谱 实验温度为37℃，pH 6.8的磷酸盐缓冲体系中；把PPO溶液与不同浓度的高良姜素溶液混合，利用荧光光度计扫描荧光光谱 (λex/λem=280/340 nm，狭缝均为5.0 nm)。

1.2.4 螯合铜离子实验 在Saiga等[12]的方法上稍加修改，本实验温度为37℃，在pH6.8的磷酸盐缓冲体系中，把CuSO4(5 μg/ml)、邻苯二酚紫(4 mmol/L)和不同浓度的高良姜素溶液混合，在632 nm 处测定OD值，参照下列公式，计算铜离子的螯合能力。螯合能力/%=(吸光值对照-吸光值样品)/吸光值对照×100%。

1.2.5 分子对接实验 PPO的PDB晶体编号为2Y9X，高良姜素晶体结构用Sybyl × 1.1 软件画出，运用AUTODOCK4.0分子模拟软件[13]进行分子对接100次，计算方法为LGA,其他参数默认设置，结果输出后采用PyMOL作图，见图1。

1.2.6 细胞系A375增殖抑制试验测定 取200 μl/孔的对数生长期人恶性黑色素瘤细胞A375(1×105/孔)接种于96孔板中，进行培养。培养24 h后，加入高良姜素(10、50、100 μg/ml)培养基，设定空白对照组，每个药物3个平行孔。分别培养24 h，每孔加入20 μl的5 mg/ml MTT试剂，在培养箱中继续培养4 h。之后把培养基吸出，加入150 μl 的DMSO试剂，充分振荡后，充分溶解结晶，再570 nm处用酶标仪测定各孔在的吸光度(OD)。计算细胞活性=实验组OD值/对照组OD值×100%。于475 nm处测定黑色素瘤细胞中黑色素生成量，并计算细胞中PPO的活性[13]。

1.2.7 A375细胞转移能力测定 在Transwell小室中加入将4.0 × 105ml-1的重悬浮细胞，在上室中加入高良姜素(10、50、100 μg/ml)培养基组，设定空白对照组，每个药物3个平行孔，培养24 h的，每孔中加入100 μl细胞悬浮液。常规细胞培养24 h。取出小室后，立即PBS溶液对滤膜进行冲洗，并擦除上室的A375细胞，之后进行染色和计数，计算A375细胞的侵袭能力。

2 结果

2.1 高良姜素对PPO活性的抑制作用 测定不同浓度的高良姜素对多酚氧化酶抑制作用的进程曲线，如图2所示，反应体系中的吸光度随着时间的延长不断增加，但是吸光值的变化率随着高良姜素浓度的增大不断地下降，即多巴胺的生成速率不断降低。

进一步分析了高良姜素对多酚氧化酶的抑制率，如图3所示，PPO的活性随着高良姜素浓度的增加呈不断下降的趋势，计算高良姜素对PPO的半数抑制浓度 (IC50) 为(47.86±3.33) μmol/L，接近于曲酸的对PPO的IC50(39.23±3.314)μmol/L，显示出高良姜素对多酚氧化酶有良好的抑制效果。

2.2 高良姜素对PPO抑制动力学研究 由图4可以看出，在双倒数图(Lineweaver-Burk作图)中，所有的直线都是相交于纵坐标的一点，这是典型的竞争性抑制作用类型。 通过Y轴的截距对不同浓度的高良姜素作图，计算得到高良姜素对PPO的抑制常数Ki 为 (24.83±1.45)μmol/L。

2.3 高良姜素对多酚氧化酶荧光光谱的影响 多酚氧化酶的内源性荧光随着高良姜素浓度的不断增加发生了明显的猝灭效应(图5)[14]，计算出结合常数Ka=(4.67±0.43) × 104L/mol。

图2 高良姜素对PPO的抑制作用的时间进程曲线Fig.2 Progress curves for inhibition against PPO by galanginNote: c(calangin)/(μmol/L)；1-5:0,20,40,80,160.

图3 高良姜素对多酚氧化酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of galangin on PPO

2.4 高良姜素对金属铜离子的螯合作用 螯合金属铜离子的能力随着高良姜素浓度的增加在不断地增强(图6)。

图4 高良姜素对PPO的双倒数曲线Fig.4 Lineweaver-Burk plot of galangin on PPONote: c(Galangin)/(μmol/L),1-4.0,25,50,100.

图5 高良姜素对PPO的荧光光谱的影响Fig.5 Effect of galangin on fluorescence spectrum of PPONote: c(Galangin)/(μmol/L),1-12.0,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220.

图6 高良姜素对金属铜离子的螯合作用Fig.6 Effects of galangin on copper ion chelating

表1 高良姜素对人黑色素瘤A375细胞的作用

Tab.1 Effects of galangin on human melanoma A375 cell

GroupsDose(μmol/L)A375cellsgrowthrate(%)PPOrelativeactivity(%)Rateofmelanin(%)A375cellsinvasiverate(%)Blankgroup0100.31±6.11100.24±5.66101.12±7.74100.76±7.34Galangingroup2074.55±4.671)67.22±6.221)66.33±6.361)73.55±6.351)4038.54±3.562)45.67±4.542)46.37±4.172)42.77±4.372)8027.76±2.542)31.55±2.332)30.56±3.442)23.55±3.092)16011.54±2.542)24.55±1.972)19.54±1.762)18.32±1.772)

Note：Compared with the blank group，1)P<0.05，2)P<0.01.

图7 高良姜素与PPO的分子对接图Fig.7 Figure of computational docking of PPO with galangin

2.5 高良姜素与PPO的分子对接 高良姜素能够很好地与PPO铜离子活性中心附近的氨基酸残基发生结合作用，见图7。

2.6 高良姜素对人黑色素瘤A375细胞的影响 表1结果显示，人黑色素瘤A375细胞的生长率以及细胞中的PPO活性、细胞侵袭率和细胞中黑色素含量都是随着高良姜素浓度的增加呈现不断降低的趋势 (P<0.05)，与对照组比较，差异均有统计学意义。

3 讨论

酶活性实验发现，在高良姜素存在下，PPO催化L-DOPA的氧化并没有出现在其他报告中的迟滞效应，只是同一反应时间不同反应体系中的吸光度变化率出现了不断下降的现象，这意味高良姜素具有PPO活性的能力[14]，而随着高良姜素浓度的增加，催化反应的吸光值的变化趋势是趋于平缓的，这表明浓度依赖性是高良姜素对PPO的抑制作用具有的属性；酶抑制类型的验证能够很大程度上表明药物的靶向作用机理，对新药开发具有重要意义，可逆的酶抑制剂具有安全、高效的应用前景，而不可逆酶抑制剂能够把酶杀死，不利于生物体机体的活力保持，因此，研究在不同底物浓度的存在下，不同浓度的高良姜素对PPO抑制效果，发现体系中Vmax保持不变，而Kmapp逐渐增大，为典型的可逆性的竞争性抑制类型，表明高良姜素能够和PPO的活性中心位置发生结合，与底物竞争结合活性位点，使PPO的催化效率下降[15,16]。在此基础上，我们进一步利用荧光光谱探明高良姜素与PPO的结合模式，通过测量发现，PPO的内源性荧光随着高良姜素浓度的增加发生了猝灭效应，也具有浓度依赖性的猝灭属性，这种猝灭方式表明高良姜素和PPO之间发生了结合作用[17]。进一步证实高良姜素与多酚氧化酶之间的结合参数，我们利用公式[18]：计算出结合常数Ka=4.67×104L/mol，当Ka>104L/mol表明高良姜素与多酚氧化酶有较强的结合能力。

上诉讨论中证实了高良姜素是一种竞争性PPO的抑制剂，荧光猝灭表明高良姜素可以与多酚氧化酶发生结合作用，为了进一步探讨高良姜素对多酚氧化酶的抑制机理，确定其是否能够与多酚氧化酶的活性中心铜离子相结合，我们进行了金属铜离子螯合实验，结果显示，高良姜素能够很好的与铜离子发生螯合反应，但是随着高良姜素的增大，螯合反应并没有趋于平缓，这可能是由于高良姜素与PPO的活性位点铜离子结合过程中，过大空间的PPO酶分子，对高良姜素插入铜离子活性中心产生了空间位阻的，迫使结合反应没有出现快速增加和缓慢的现象，这种现象能够很大程度地反映高良姜素的药效持续时间长的优点。分子对接中对接区域最多的和能量最低的位点是我们的研究对象，分子对接结果显示酶的活性中心位置为高良姜素与PPO的结合区域，催化中心的氨基酸残基包括His85、Arg95、His244、His259、Asn260、His263、Phe264、Gly281、Val283、His296等[15]，并与His259形成氢键，占据活性位点，这是高良姜素对PPO的抑制作用机理。细胞实验发现，当高良姜素存在人黑色素瘤A375的生长和转移出现了抑制效应，A375细胞内PPO活性也随着高良姜素的浓度增加在下降，进而细胞合成黑色素量也出现下降，因此低毒性的高良姜素能够很好地值得临床应用和推广。

本研究首次应用荧光光谱和铜离子螯合实验探讨了高良姜素与PPO的结合模式，从分子层面探明了高良姜素对PPO的抑制机理，从而降低黑色素瘤的增殖和转移速率，这为系统的分析中药药效理论以及多种活性组分对PPO的抑制协同作用的探索做出贡献。

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[收稿2016-11-03 修回2017-03-05]

(编辑 许四平 刘格格)

Inhibitory effect of galangin on polyphenol oxidase and study of mechanism

YANGJia-Ning，DENGFei，PANNing.

DepartmentofDermatologicalSurgery,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China

Objective:To investigated the activity inhibition and inhibitory type of polyphenol oxidase (PPO) induced by galangin and the interaction mechanism of galangin with polyphenol oxidase was preliminarily indicated,and prove the related mechanism of galangin on proliferation of on human melanoma A375 cells.Methods: The activity inhibition and inhibitory type of PPO induced by galangin were investigated by spectrophotometric method,and interation mechanism of galangin with PPO was preliminarily indicated by fluorescence quenching and molecular docking,and chelating copper ions with the inhibitory mechanism of galangin on polyphenol oxidase was measured.Results: Galangin was a competitive inhibitor,the IC50and Ki on PPO were obtained to be (47.86±3.33) and (24.83±1.45)μmol/L,respectively.Fluorescence spectrum indicated the fluorescence of PPO was quenched effectively by galangin and the binding constant Ka was obtained to be (4.67±0.43)×104L/mol.Chelating copper ions and molecular simulation further showed that galangin was combined with active center of copper ions,and formed hydrogen bonds with catalytic site His259.Luteolin could induce the apoptosis of A375 cells significantly,and the tyrosinase activity and melanin synthesis were decreased.Conclusion: Galangin as a competitive polyphenol oxidase inhibitor and reduced the activity of polyphenol oxidase.which provides the theoretical basis for the clinical anti skin cancer.

Galangin;Polyphenol oxidase;Inhibitory effect;Fluorescence spectrum;Chelating copper ions;Human melanoma A375 cells;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.009

①本文为四川省卫计委科研课题(No.140084)。

杨镓宁(1981年-)，男，硕士，主治医师，主要从事皮肤肿瘤的基础与临床研究，E-mail：heqiusl@sina.com。

R739.5 O657.3

A

1000-484X(2017)07-1000-05

②四川省医学科学院四川省人民医院肾脏内科,成都610072。