类风湿性关节炎新型自身抗原视黄醇结合蛋白1类似蛋白相关分析研究①

童晓鹏 张 敏

(西藏民族大学，咸阳712082)

类风湿性关节炎新型自身抗原视黄醇结合蛋白1类似蛋白相关分析研究①

童晓鹏 张 敏②

(西藏民族大学，咸阳712082)

目的：类风湿性关节炎(RA)是一种全身性自身免疫性疾病，但其发病原因尚不清楚。因此，迫切需要找到诱发此病的相关抗原，但国内外鲜有关于新的自身抗原的报道，本课题组运用克隆技术发现新型自身抗原。方法：从滑膜细胞中提取mRNA，构建cDNA文库，取类风湿性关节炎患者关节滑膜液中的抗体作为探针，筛选cDNA基因库，得到阳性克隆后测序分析，寻找已知相似基因，进而分析蛋白质的构造和Northern印迹杂交(Northern blotting)。结果：发现新型自身抗原cDNA克隆，其与视黄醇结合蛋白1(RBP1)有36.5%的氨基酸序列相同，并发现AT-rich interaction domain，chromo domain，A+T-hook以及TAF homology domain这些特殊的蛋白质构造。因此将其命名为视黄醇结合蛋白1类似蛋白(RBP1 like protein，Rbik)。Rbik RNA不仅表达于滑膜，也表达于心脏、小肠、肌肉等多个器官组织中。结论：此自身抗原的发现可为类风湿性关节炎的实验诊断和治疗提供新的可能指标和靶点。

类风湿性关节炎；自身抗原；RBP1；克隆；免疫

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性滑膜炎为特点的进行性关节病变的自身免疫性疾病，可导致对称性的多关节炎，但其病因尚未明确[1]。近年来，新的药物研制成功，改善了RA的疗效，极大地推动了RA在治疗方面的进展，但仍有许多不足之处。例如，新的细胞因子拮抗剂和非甾体类抗炎镇痛药物均可减轻患者的关节疼痛、肿胀，起到改善关节功能的作用，但并不能阻止或者减缓疾病的进展和关节的继续破坏，而且有胃肠道不良反应，因此，其应用受到极大限制[2，3]；此外，在RA治疗中，糖皮质激素也是一类常用的药物，但其作用却一直备受争议，口服小剂量糖皮质激素可较快地改善关节功能且显著缓解关节症状，但长期使用易产生激素依赖性及其他不良反应[4]；近年来，也有一些生物制剂用于RA治疗，其虽可快速缓解症状，改善病情，但长期使用可诱导患者产生大量抗药物抗体，治疗效果下降[5，6]。因此，目前国内外许多机构致力于寻找RA相关抗原，期望为RA治疗提供新的指标和靶点，但是至今仍鲜有新的自身抗原被发现[7-10]。本研究以RA患者关节滑膜液中的抗体为探针，运用克隆技术得到新型自身抗原cDNA，并对其进行了初步分析。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 患者信息 根据美国类风湿病协会标准，收集陕西中医药大学附属医院内科2010 年6月～2015年7月间收治的67例类风湿关节炎患者和30例健康者的血清。选取近期收治的18例RA患者，用关节穿刺术抽取滑膜液并收集手术过程中切除的滑膜组织。

1.1.2 试剂 蛋白质(Protein) A beads ( bio PROCESSING，Durham，UK)；0.25% 胶原酶(Coll-agenase S-1；Nitta Gelatin，Osaka，Japan)；TRIzol试剂(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)；oligo(dT)-latex beads(Oligotex-dT30；Takara Shuzo，Otsu，Japan)；TimeSaver cDNA synthesis kit (Pharmacia)；Chroma spin-400 columns(Clontech，Palo Alto，CA)；Gene Checker kit(Invitrogen，San Diego，CA)；聚酰胺纤维膜(GeneScreen Plus；NEN Research，Boston，MA)；过氧化物酶结合山羊抗人IgG(Cappel #55252；OrganonTeknica，Durham，NC)；ECL发光液(Amers-ham，Amer-sham，UK)。

1.2 方法

1.2.1 血清和滑膜液及SFIgG的提纯 用关节穿刺术抽取滑膜液。用蛋白质(Protein)Abeads纯化滑膜液IgG，运用SDS-PAGE法检测提纯的SFIgG。便于cDNA基因库的免疫筛选。

1.2.2 从培养的滑膜细胞中提取 mRNA在对18例RA患者进行滑膜切除手术过程中，取少量滑膜切碎后放入RPMI1640中，用0.25%胶原酶消化，离心沉淀细胞(500 r/min，5 min)，37℃，5%CO2孵育7 d 后，TRIzol试剂裂解细胞，提取总RNA。

1.2.3 构建cDNA基因库 首先，使用oligo(dT)-latex beads从RA患者滑膜细胞中的总RNA中提纯并纯化poly(A)+RNA(10 μg)。然后用TimeSaver cDNA synthesis kit逆转录合成cDNA。运用Chroma spin-400 columns选择并使用Eco RI编译合成大于200 bp的cDNA产物。

1.2.4 检测cDNA基因库 将从λExCell DNA中酶切出的cDNA片段电泳后，利用image (AE-6905C)软件分析cDNA片段的分布。应用Gene Checker kit和PCR结果分析，评估克隆的cDNA种类。

1.2.5 cDNA基因库免疫筛选 基因库筛选之前，从18例RA患者中挑选6例比较好的患者 (RF≥100) 的滑膜细胞裂解产物SFIgG溶液，然后运用免疫印迹法在SFIgG溶液中筛选hexamer以及Not Ioligo(dT)的cDNA基因库。依次使用3%、0.5%、0%Tween 20的PBS洗涤血小板转移膜，用5%脱脂奶粉封闭，随后在SFIgG溶液中4℃过夜。次日，弃SFIgG溶液，重复以上洗涤方法后，继续室温孵育过氧化物酶结合山羊抗人IgG 1 h。再次重复以上洗涤方法后，滴加ECL显色，观察分析结果。不断反复筛选，直到阳性克隆呈全部阳性。

1.2.6 cDNA测序和分析 使用373 DNA测序系统(AppliedBiosystems)测序，并通过DNA Data Bank of Japan(DDBJ)寻找已知的相似基因。

1.2.7 Northern印迹杂交(Northern blotting)法 用TRIzol(Gibco/BRL)法提取新鲜滑膜组织中的RNA。取20 μg总RNA进行琼脂糖凝胶(1.33%)电泳分离，然后转入聚酰胺纤维膜中。使用50 μCi[α-32 P]三磷酸脱氧胞苷(NEG-513H；NEN Research)标记由SmaⅠ和NotⅠ消化制备的RbikcDNA探针(50 ng)。将制备的探针加到聚酰胺纤维膜上后，放置于imaging plate(BAS-Ⅲ；Fuji Photo Film)反应12 h或24 h。用image 分析系统(AS-2000 Ⅱ and Bastation；Fuji Photo Film)分析结果。

2 结果

2.1 新型RA自身抗原cDNA克隆的发现 用hexamer以及Not Ioligo(dT)筛选两个cDNA基因库后发现其分别包含了50 000 和150 000的克隆且平均长度均为1 kb。结果显示，两个cDNA基因库互补，如图1A、B。提纯的SFIgG经过确认，如图1C。一个4 405 bp的新型阳性克隆发现(在DDBJ/EMBL/Genbank的登录号为AB030181)。

2.2 测序分析 对新型自身抗原cDNA进行测序分析后，发现其与RBP1有36.5%的氨基酸序列相同，因此命名为黄醇结合蛋白1类似蛋白(RBP1-like protein，Rbik)。使用BLOCKS程序分析蛋白质构造，发现AT-rich interaction domain，chromo domain，A+T-hook以及TAF homology domain这些特殊构造，其与细胞周期以及细胞增殖相关，如图2。

图1 检测cDNA基因库以及SFIgG的提纯Fig.1 Immunological screening of cDNA librariesNote: A.cDNA gene librarywas decomposed by Eco RⅠ(1) and NotⅠ(2);B.cDNA gene library was analyzed by PCR using primers from Gene Checker kit(Invitrogen);C.The silver staining of the SFlgG probe which was analyzed by SDS-PAGE showing no additional bands.

图2 使用BLOCKS程序分析蛋白质构造Fig.2 Analysis of protein structure by BLOCKS

图3 Northern blotting法检测结果Fig.3 Analysis of Northern blotting

2.3 Northern blotting法检测结果 Northern blotting结果显示，Rbik RNA不属于滑膜组织中特异性表达的基因，在心脏、小肠、肌肉等多个器官组织均有表达。如图3。

3 讨论

近年来报道的类风湿性关节炎新型自身抗原有糖蛋白-39(Glycoprotein-39)[11]和钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)[12]。RA患者的外周血T细胞可识别来源于软骨组织中的Glycoprotein-39，并且该自身抗原与RA的慢性炎症发展相关。与其他自身免疫病相比，RA患者血清中高频率出现Calpastatin自身抗原，这与RA的病因病理机制存在相关性。但是这两种自身抗原的cDNA库构建都来自于其他组织或者细胞。

因此，本研究运用克隆技术，以类风湿性关节炎患者关节滑膜液中的抗体为探针得到新型cDNA。因与黄醇结合蛋白1(Retinol binding protein 1，RBP1)有36.5%相同的氨基酸序列而被命名为RBP1类似蛋白。RBP1是由肝脏合成的维生素转运蛋白，在血液、脑脊液、尿液及其他体液中广泛存在。目前研究认为RBP1与癌症抑制蛋白RB蛋白结合，并促进其他相关蛋白的结合，对转录有一定调节作用。本研究使用BLOCKS程序分析蛋白质构造，发现AT-rich interaction domain，chromo domain，A+T-hook以及TAF homology domain这些特殊构造，其与细胞周期以及细胞增殖相关。在Northern blotting法中，可见Rbik RNA不仅表达于滑膜，也表达于心脏、小肠、肌肉等多个器官组织中。此自身抗原的发现有望为RA的实验诊断和治疗提供新的指标和靶点。此外，由于其和RBP1的相似性，所以对细胞周期以及细胞增殖的作用，值得进一步研究。因此，下一步本课题组将从其结构分布的特殊性着手，进一步分析其临床诊断RA及其他自身免疫疾病的价值，探索其临床应用以及作用机理。

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[收稿2017-01-12 修回2017-03-22]

(编辑 张晓舟)

Research of RBP1 like protein——a novel autoantigen in RA

TONGXiao-Peng,ZHANGMin.

XizangMinzuUniversity,Xianyang712082,China

Objective:Rheumatoid arthritis(RA) is a systemic autoimmune disease,but its etiology is unclear.Therefore,it is urgent to search antigens which is relate to induce this disease,however,there are few reports about the new self-antigens at home and abroad.In this study,we investigate new autoantigen through cloning.Methods: We used antigens in synovium of patients with rheumatoid arthritis as probe,extracted mRNA from synoviocyte,performed cDNA library immunological screening and sequence,and analyzed the conformation and performed Northern blotting.Results: We found that new autoantigen had 36.5% homology with retinoblastoma binding protein 1(RBP1)and it was found that these special protein structure such as AT-rich interaction domain,chromo domain,A+T-hook and TAF homology domain.Therefore,it will be named RBP1-like Protein(Rbik).Rbik RNA is not only expressed in the synovial membrane,but also in the heart,small intestine,muscle and other organs.Conclusion: We report that the discovery of the new autoantibodies to RBP1-like Protein(Rbik)may provide a new possible index and target in diagnosis and therapy.

RA;Autoantigen;RBP1;Cloning;Immunology

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.004

①本文为国家自然科学基金资助项目(81560732，81560668)、西藏自治区自然科学基金项目(2015ZR-13-18)和西藏自治区高校青年教师创新支持计划项目(QC2015-61)。

童晓鹏(1980年-)，男，博士，副教授，主要从事类风湿性关节炎病理机制研究。

R392.3

A

1000-484X(2017)07-0976-03

②通讯作者，西藏民族大学生命科学基础实验室，咸阳712082，E-mail:88021470@qq.com。