三七皂苷在JNK介导的低氧高二氧化碳性肺动脉高压模型中的机制探讨

周小雄++++++叶桃春++++++罗川晋++++++吴辉++++++褚庆民++++++赵新军

[摘要] 目的 研究JNK信号通路在大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉高压（HHPH）发生发展中的动态变化，探讨三七皂苷（PNS）防治HHPH的机制。 方法 复制慢性HHPH的SD大鼠模型，分为正常组（N，n=10），低O2高CO2组（H4w，n=10）及PNS治疗组（Hp4w，n=10）。RT-qPCR及Western blot检测JNK mRNA及蛋白表达情况。原代培养SD大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs），取2～5代对数生长期细胞，分为正常组（N）、低O2高CO2组（H）及PNS治疗组（R10、R50、R100），PNS治疗组分别用不同浓度（10、50、100 mg/L）的三七皂苷单体R1进行处理，24 h后收集细胞，RT-qPCR及WesternBlot检测JNK mRNA及蛋白表达情况。然后用R1及JNK抑制剂SP600125分别及联合处理PASMCs 5 d，CCK8检测细胞增殖情况。 结果 ①与N组相比，H4w组和Hp4w组mPAP均明显增高（P < 0.05），同时Hp4w组mPAP明显低于H4w组（P < 0.05）。②肺组织JNK mRNA在H4w组中表达最高，N组最低，Hp4w组介于两组之间（均P < 0.05）；p-JNK蛋白在H4w组较N组高表达（P < 0.05），Hp4w組较H4w组下降（P < 0.05）。③PASMCs H组JNK mRNA及蛋白表达明显高于N组（P < 0.05），与H组相比，R1（10、50、100 mg/L）不同程度抑制了JNK mRNA及蛋白表达（P < 0.05）。④PNS及SP600125处理组PASMCs均出现了明显的增殖受抑（P < 0.05）。 结论 JNK信号通路参与了大鼠HHPH的形成。PNS可减轻这一过程，其机制可能与PNS抑制JNK的表达与激活有关。

[关键词] 三七皂苷；低氧高二氧化碳；肺动脉高压

[中图分类号] R543.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the dynamic change of JNK signaling pathway in the occurrence and development of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension in rats， discuss the mechanism of panax notoginoside （PNS） in the protection of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension. Methods Rats pathological models of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension were established： SD rats were randomly divided into three groups （n=10）： normal group （N group）， hypoxic hypercapnia for 4 week group （H4w group）， and PNS-injected group （Hp4w group）. RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of JNK. Primary cultured PASMCs， isolated from SD rats， were incubated in logarithmic growth phase from the 2nd to 5th generation. PASMCs were divided into five groups： normal group （N group）， hypoxic hypercapnia group （H group）， and R1 treated group with different concentrations （10， 50 and 100 mg/L） of notoginsenoside monomer R1 under the condition of 6% CO2 plus 1% O2 for 24 h （R10， R50 and R100 groups）. The expressions of JNK mRNA and protein levels were detected by RT-qPCR and Western blot. PASMCs were treated with R1 and JNK inhibitor SP600125 for 5 days， CCK8 was used to detect the proliferation of PASMCs. Results ①The mPAP in H4w and Hp4w group was higher than that of N group （P < 0.05）， but mPAP in Hp4w group was obviously lower than that of H4w group （P < 0.05）. ②The mRNA and protein levels of JNK were significantly increased in H4w and Hp4w groups， compared with N group （P < 0.05）， and Hp4w group was lower than H4w group （P < 0.05）. ③The protein and mRNA expression levels of JNK in PASMCs were significantly higher in H group than those in N group （P < 0.05）； compared with H group， in R1 treatment （10， 50 and 100 mg/L） groups， the expression levels of JNK were markedly decreased （P < 0.05）. ④The proliferation of PASMCs were significantly inhibited in groups treated with R1 and JNK inhibitor SP600125 （P < 0.05）. Conclusion JNK may play an important role in the development of hypoxia induced pulmonary hypertension. The effect of PNS on reducing pulmonary hypertension and improving pulmonary vascular wall remodeling may be partly related to its inhibition of JNK pathway.

[Key words] Panax notoginoside； Hypoxic hypercapnia； Pulmonary arterial hypertension

低氧高二氧化碳性肺动脉高压（hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH）以肺血管阻力增加为主要表现[1-2]。目前研究显示，HHPH是由于肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖异常，导致远端肺动脉腔狭窄阻塞，引起肺血管的阻力增加[3-4]。因此，对于平滑肌细胞增殖的抑制或能逆转肺动脉，改善远端肺动脉重构，是预防和治疗肺动脉高压的关键措施之一。三七的主要成分三七皂苷（panax notogino side，PNS）具有调节血液循环、改善血流动力学等多种生理功能。之前研究发现，PNS的主要成分三七皂苷单体R1（notoginsenoside monomer R1，R1）能通过抑制MAPK通路延缓大鼠HHPH的形成[5]。

MAPK是一组保守的丝/苏氨酸激酶，其家族成员包括ERK1/2、p38激酶、JNK/SAPK等，广泛参与炎症、癌变等生理病理过程。研究报道，R1能够显著降低低氧高二氧化碳条件下PASMCs中p-ERK1/2[6]、p-p38[7]的水平，从而抑制平滑肌细胞的增殖和迁移。而JNK在PASMCs中是否也起到了类似作用，尚无文献报道。本研究通过检测肺动脉高压大鼠模型中JNK的活化水平，体外用PNS对PASMCs进行干预，检测JNK通路的变化，探讨PNS治疗HHPH的可能作用机制，为临床治疗肺动脉高压提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与药品

SPF级雄性SD大鼠30只，体重250～300 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：No.44005800002610。血塞通注射液（有效成分为PNS，昆明兴中制药厂生产，批号：20100808）、5%水合氯醛、Olympus显微照像仪、Powerlab四道记录仪、呼吸机、Bio-Rad化学显像仪、Thermo Fisher Scientific ViiA7 Real-Time PCR System。胎牛血清、DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），三七皂苷单体R1（广州中医药大学医学院有机化学教研室提供），RT-qPCR试剂盒（日本TaKaRa公司），化学发光试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（北京鼎国昌盛生物公司），小鼠抗大鼠磷酸化JNK抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（美国Cell Signal Technology公司），JNK抑制剂SP600125（Selleck，S1460），CCK8（Selleck）。研究符合动物实验伦理准则。

1.2 慢性HHPH大鼠模型的复制

随机将SD大鼠分成N、H4w和Hp4w共3组，每组10只。将H4w和Hp4w组置于低氧高二氧化碳舱内，保持O2浓度为9%～11%，CO2浓度为5%～6%，每天8 h，每周6 d。Hp4w组每日于腹腔注射血塞通注射液[50 mg/（kg·d）]，H4w组大鼠同时注射等量的生理盐水，注射半小时后入舱。N组置于舱外，呼吸正常空气。三组均饲养4周后进行后续实验。

1.3 大鼠血流動力学测定

经处理4周后，对大鼠进行腹腔麻醉（腹腔注射5%水合氯醛），固定于手术台上，行颈正中切口，于左侧分离出左颈外静脉，自左颈外静脉插管至肺动脉，Powerlab生理记录仪测定其平均肺动脉压（mPAP）；右侧分离出右颈总动脉，插管测量其平均颈动脉压（mCAP）。以mPAP>15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作为模型建立成功的指标。

1.4 PASMCs的分离和培养

处死大鼠，在75%酒精中浸泡后取出肺叶，在超净工作台内解剖显微镜直视下取出2～4级肺动脉，剥离外膜，去除内皮细胞，将其剪碎，0.2%胶原酶Ⅰ于37℃消化30 min，后终止消化，转入离心管中1000 r/min离心5 min，弃上清，加DMEM（20%FBS）接种至100 mm培养皿中，常规CO2培养箱中培养，观察细胞贴壁情况及细胞形态，待血管平滑肌细胞达90%以上时，进行下一步实验。

1.5 PASMCs药物处理分组

将第3～5代处于对数生长期的PASMCs接种于6孔板中（5×105个/mL，2 mL/孔），采用高糖DMEM培养液+10%FBS培养，待细胞长至80%融合度时换成无血清DMEM培养基继续培养24 h后，加药物处理。实验分组分为：常氧组（N）：不给予任何处理因素，气体条件为5%CO2+21%O2，37℃孵育24 h；低氧高二氧化碳组（H）：加入PBS，气体条件为6%CO2+1%O2，37℃孵育24 h；R1干预组（R10、R50、R100）：分别加入10、50、100 mg/mL R1，气体条件为6%CO2+1%O2，37℃孵育24 h。

1.6 JNK mRNA表达水平检测

取组织或细胞，加1 mL Trizol，反复吹打后再加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s后静置，4℃ 12 000 r/min离心15 min，转移上层水相，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，静置5 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min。弃上清，加入1 mL 75%乙醇，4℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，晾干后加入适量DEPC水溶解。逆转录RNA合成cDNA。qPCR检测JNK mRNA表达丰度。反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性15 s，60℃ 延伸60 s，40个循环。实验结果以GAPDH为内对照，计算ΔΔCT值，进行分析。GAPDH（Rat）上游序列：5′-ACT？鄄CCCATTCTTCCACCTTTG-3′，下游序列：5′-CCCTGTT？鄄GCTGTAGCCATATT-3′；JNK（Rat）上游序列：5′-AAGATCCCTGACAAGCAGTTAG-3′，下游序列：5′-TCTTAGTTCGCTCCTCCAAATC-3′。

1.7 Western blot检测磷酸化JNK 蛋白含量

各组取组织或细胞，加入适量裂解液，裂解30 min，超声粉碎仪充分裂解细胞后，4℃ 12 000 r/min离心15 min，吸取上清，于-80℃保存。BCA法测定蛋白浓度。电泳采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，恒压80 V 30 min，改120 V至溴酚蓝跑到凝胶底部。PVDF膜转膜，100 V恒流电转90 min，后3%BSA封闭1 h，洗膜后加p-JNK抗体（CST，1∶1000），4℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗（Santa Cruz，1∶5000），室温孵育2 h，TBST洗膜3次，化学发光底物ECL显色，BioRad化学发光成像系统进行显影。

1.8 PASMCs细胞增殖能力检测

将肺动脉平滑肌细胞（1×103个/孔）接种于96孔培养板。待细胞长至60%的融合度，弃原细胞培养液，饥饿处理24 h。分别及联合加入R1（50 mg/ml）和JNK抑制剂SP600125（40 nmol/L），药物处理5 d后，每孔加入10 μL CCK8，37℃继续培养2 h，在酶标仪450 nm波长下测吸光度，计算细胞增殖情况。

1.9统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠平均颈动脉压及平均肺动脉压比较

2.1.1 各组大鼠平均颈动脉压比较 N组、H4w组和Hp4w组大鼠组间mCAP差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。提示低氧高二氧化碳对大鼠的体循环压没有影响。

2.1.2 各组大鼠平均肺动脉压比较 H4w组和Hp4w组mPAP均高于N组，差异有统计学意义（P < 0.05），说明低氧高二氧化碳处理4周后大鼠会出现明显的肺动脉高压。同时，H4w组mPAP明显高于Hp4w组（P < 0.05），提示PNS可能有利于减缓低氧高二氧化碳引起的肺动脉高压。见表1。

2.2 各组大鼠肺组织中JNK mRNA及蛋白水平比较

2.2.1 各组大鼠肺组织中JNK mRNA水平比较 qPCR结果显示，各组大鼠肺组织中JNK mRNA出现明显变化，在N组中JNK mRNA水平不高，給予低氧高二氧化碳处理4周后，JNK mRNA表达显著增加（P < 0.05），而加入PNS处理后的Hp4w组JNK mRNA明显低于H4w组，但仍高于N组水平（P < 0.05）。见图1。

2.2.2 各组大鼠肺组织匀浆JNK蛋白水平比较 各组肺组织匀浆p-JNK出现明显变化，在N组中p-JNK蛋白未见表达，给予低氧高二氧化碳处理4周后，p-JNK蛋白表达显著增强（P < 0.05），而加入PNS处理后的Hp4w组p-JNK蛋白明显低于H4w组（P < 0.05），但仍高于N组水平。见图2。

2.3 各组PASMCs中JNK mRNA及蛋白水平比较

2.3.1 各组PASMCs中JNK mRNA相对表达量比较 H组和R1各浓度组JNK mRNA表达水平较N组均明显增加（P < 0.05）；R1各浓度组间JNK mRNA表达呈剂量依赖性，随R1浓度增高，JNK mRNA表达水平次第下降，且R100组和R10组之间的JNK mRNA表达水平差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.3.2 各组PASMCs中JNK蛋白表达量比较 N组p-JNK蛋白表达较弱，H组和R1各浓度组JNK mRNA表达水平较N组均明显增加（P < 0.05）；R1各浓度组与H组相比，p-JNK蛋白表达水平均出现显著下调（P < 0.05）。R1各浓度组之间p-JNK表达呈剂量依赖性，随R1浓度增高，p-JNK表达水平次第下降，R100组和R10组间比较，差异有统计学意义（P < 0.05），二者与R50组之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

2.4 JNK对PASMCs增殖的影响

利用CCK8测定PNS及JNK抑制剂SP600125对PASMCs增殖的影响，结果显示，与未处理组相比，处理组均出现了明显的增殖受抑（P < 0.05），而相比单药处理组，PNS及SP600125联合处理组出现了一个轻微的累加效应（P < 0.05）。见图5。

3 讨论

肺动脉高压是慢性、严重的致命性疾病，可继发于心、肺、全身性疾患或原因不明，主要表现为进行性呼吸困难，最终导致右心衰竭而死。肺动脉高压与肺动脉内细胞的活化增殖相关。平滑肌细胞增殖和伴随的迁移使血管介质变厚，侵入内膜并参与丛状体的形成[8]。目前认为，低氧高二氧化碳引起HHPH主要有两大机制[9]：①介质学说认为，低氧可以激活NO、ET等因子引起血管的收缩与舒张；②直接学说认为，低氧可直接刺激PASMCs，引起PASMCs的收缩、增殖、迁移等改变，导致肺血管阻力增加。低氧是引起PASMCs增殖的重要因素，此外，钙内流引起的细胞内代谢紊乱也是其中原因之一[10-11]。

三七总皂苷是五加科人参属植物三七的主要成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、扩张血管、抗血小板凝集等生物学功能。有文献报道，PNS能抑制慢性缺氧大鼠内皮细胞NO的合成与释放，进而延缓慢性低氧性肺动脉高压的进程[12]。目前认为，三七皂苷是一种钙拮抗剂，能够通过抑制MAPK 通路来减轻肺动脉高压的程度，而其主要成分单体R1具有相似的作用[6-7]。

本实验结果显示，HHPH模型鼠加用PNS药物治疗后，其mPAP出现显著降低，而mCAP未发生明显改变，提示PNS可能延缓HHPH的进程，而不造成体循环的改变，即PNS对HHPH具有选择性抑制作用。同时，H4w组大鼠肺组织中JNK mRNA水平出现明显改变，JNK表达显著增加；而加入PNS后的Hp4w组相较于H4w组，JNK mRNA表达水平显著下降，其磷酸化活性也出现明显降低，提示JNK可能参与了肺动脉高压的形成，而PNS则通过部分阻断JNK通路的活化，而达到降低肺动脉高压的目的。体外研究表明，在低氧高二氧化碳条件下，肺动脉平滑肌细胞在加用低、中、高剂量R1处理后，其p-JNK蛋白表达均明显低于未加药组。PNS处理组PASMCs增殖速率明显下降，而PNS与JNK抑制剂联合处理组出现协同效应，提示除JNK通路外，PNS可能还参与了其他信号通路的调节。

目前研究显示，在HHPH大鼠模型中肺小血管的重塑与JNK/MAPK通路的激活密切相关[13-15]。MAPK通路的激活介导了肺动脉高压过程中PASMCs的增殖[16-18]，然而究竟是什么引起了MAPK通路的激活、p38及JNK的磷酸化，继而促进了细胞的增殖失控，尚不清楚。有研究推测，缺氧内环境及持续的钙内流钙超载可能是引起MAPK通路激活的原因[19-20]。PNS作为一种钙拮抗剂，可能由此参与了MAPK通路的调节，而PNS在MAPK激活过程中是怎样参与其中，JNK、p38等分子又是怎樣调节PASMCs增殖的，目前尚不明确。此外，PNS是否还有其他的作用机制，能否通过调节其他信号通路来达到延缓肺动脉高压的目的，尚需进一步研究。

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