细胞氧化—还原状态影响贝母素甲对人白血病细胞K562细胞增殖的抑制

齐彦++++++廖斌++++++徐成波++++++皇甫真萍++++++陈佳薇

[摘要] 目的 探讨贝母素甲对人白血病细胞K562细胞增殖的抑制效应，以及细胞氧化-还原状态失衡对此作用的影响。 方法 在体外培养K562细胞。运用四唑盐（MTT）比色法分析不同浓度贝母素甲（50、100、200、400、800 μmol/L）处理24 h对K562细胞增殖的影响，并用Bliss法计算药物对细胞的半数抑制浓度（IC50）。采用分光光度法分别分析药物处理对K562细胞内活性氧（ROS）与谷胱甘肽（GSH）含量的影响。 结果 贝母素甲能剂量依赖性的抑制K562细胞的增殖，IC50为238 μmol/L。贝母素甲能诱导K562细胞产生ROS，下调其细胞内GSH含量，破坏细胞的氧化-还原平衡状态。活性氧清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）与GSH的预处理可以抑制贝母素甲的上述效应。 结论 贝母素甲可抑制K562细胞增殖，细胞氧化-还原失衡可能在这一过程中起重要作用。

[关键词] 贝母素甲；K562细胞；氧化-还原；细胞增殖

[中图分类号] R733.7；R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0016-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of peimine on cell proliferation of human leukemia K562 cells and the function of redox imbalance in this progress. Methods The human leukemia K562 cells were cultured in vitro. After K562 cells were treated with peimine at concentrations of 50， 100， 200， 400 and 800 μmol/L for 24 h， the cell proliferation was measured by thiazolyl blue tetrazolium bromide （MTT） assay. And the half maximal inhibitory concentration （IC50） of peimine was calculated using the Bliss method. The changes of intracellular reactive oxygen species （ROS） and glutathione （GSH） concentration were detected using spectrophotometry. Results Peimine inhibited the proliferation of K562 cells in a dose-dependent manner. And the IC50 of peimine was 238 μmol/L. Furthermore， peimine could promote the ROS production and glutathione （GSH） depletion. The balance of oxidation-antioxidation function destroyed. Pre-incubation with antioxidants GSH or N acetyl cysteine （NAC） almost abolished the effects of peimine. Conclusion The present study therefore shows that peimine inhibits the proliferation activity in K562 cells. The redox imbalance may play a key role in this process.

[Key words] Peimine； K562 cells； Redox； Cell proliferation

浙貝母为临床常用止咳化痰中药，始载于《本草正》，为贝母属植物浙贝母（Fritillatia thunbergii Miq.）的干燥鳞茎[1]。贝母素甲（Peimine）是浙贝母的主要药效成分之一[2]，对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用，能逆转肿瘤细胞的多耐药现象[2-7]。以浙贝母为君药的复方淅贝母颗粒能提高难治性急性白血病围化疗期临床缓解率[8]。尽管这些研究提示贝母素甲具有抗肿瘤活性，但其对慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leu？鄄kemia，CML）细胞增殖影响的研究依然甚少，诸多相关问题有待厘清。

细胞在生命活动过程中会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。同时，细胞中还存在谷胱甘肽（glutathione，GSH）、过氧化氢酶（catalase，GAT）等构成的抗氧化系统，可清除过多的ROS，避免细胞受到过度的氧化损伤[9]。ROS的生成与清除之间的动态平衡使细胞处于一个正常的氧化-还原状态，维持细胞生长、增殖等正常生命过程[10-12]。此状态的失衡会导致细胞活力下降，甚至死亡。Bcr-Abl突变的CML细胞ROS水平比正常细胞高，对氧化-还原状态的改变更为敏感[13]。一些药物可通过诱导肿瘤细胞ROS爆发、GSH含量下调，抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，从而起到抗肿瘤的效果[14-16]。

对此，本项研究采用人白血病细胞株K562为体外研究模型，试图从细胞氧化-还原状态变化的角度分析贝母素甲对人白血病细胞体外增殖的影响机制，为贝母素甲用于人白血病治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人慢性粒细胞白血病细胞株K562由福建中医药大学中西医结合基础实验室保存。

1.2 实验药物

贝母素甲（Peimine，纯度> 98%）产自美国阿拉丁工业公司。称取21.6 mg贝母素甲，采用0.2 mL无水乙醇助溶，再加19.8 mL RPMI 1640 培养基，配制成50 mmol/L工作液，过滤除菌，保存于-20℃备用。

1.3 主要试剂及设备

培养基RPMI 1640与胎牛血清（fetal calf serum，FBS）为Gibco公司生产；MTT[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide]和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）产自Amresco公司；还原型谷胱苷肽（glutathione，GSH）、N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cystein，NAC）、GSH检测试剂盒（S0053）和活性氧检测试剂盒（S0033）购自碧云天生物技术研究所。CO2培养箱为德国Heraeus公司产品，超净工作台产于苏州净化设备有限公司，倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，ELX800全自动酶标仪产自BioTek公司，Infinite 200 PRO全波长多功能微孔板检测仪产自瑞士TECAN公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 K562细胞培养于RPMI 1640培养基（含10%FBS），培养环境为37℃、饱和湿度、5%CO2，3d传代1次，收取对数生长期细胞用于实验。

1.4.2 细胞增殖的检测 将对数生长期的K562细胞（4×104个/mL）同步化后接种于96孔板内，每孔加细胞悬液100 μL。各药物组加入贝母素甲至终浓度分别为50、100、200、400、800 μmol/L，空白对照组加等体积的药物溶解介质。清除剂实验中，用GSH（5 mmol/L）或NAC（5 mmol/L）分别预处理K562细胞1 h，然后进行相应的药物处理。加药处理24 h后，每孔加MTT至0.5 mg/mL，常规培养3 h，离心弃上清，加100 μL DMSO溶解沉淀。采用570 nm为主波长，630 nm为参比波长，测定各孔光吸收值（A值）。细胞增殖抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%，药物对细胞的半数抑制浓度（IC50）采用Bliss法。实验重复3次。

1.4.3 细胞ROS含量的检测 参照文献[17]所述方法进行测量。大致如下：同步化适量的K562细胞并随机分组。以不同终浓度贝母素甲处理的为药物组，以加等体积药物溶解介质处理的为空白对照组。抑制剂实验中，采用ROS清除剂NAC预处理细胞1 h，然后进行相应的药物处理。常规培养细胞9 h后，各组细胞加ROS特异性荧光探针DCFH2-CA至10 μmol/L，37℃避光培养30 min，收集并用无血清细胞培养液洗涤细胞。采用激发波长488 nm，发射波长525 nm，于全波长多功能微孔板检测仪检测。以相对于空白对照组的倍数表示各组的ROS含量。实验重复3次。

1.4.4 细胞GSH含量的检测 按“1.4.3”所述方法分组并处理细胞，常规培养24 h后收集细胞，PBS洗涤1次，加入适量蛋白去除试剂溶液，振荡混匀，反复冻融破碎细胞，离心取上清液进行测定。具体方法参照试剂盒说明书进行，405 nm处检测光吸收值，计算GSH含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 贝母素甲对K562细胞增殖的抑制

利用MTT法检测细胞活力是分析细胞增殖的一种快捷、常用的方法。本研究结果表明，各药物组与空白对照组相比，100、200、400、800 μmol/L浓度组的吸光值显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05），抑制率随药物浓度增大而升高。贝母素甲对K562的IC50为238 μmol/L。上述结果提示贝母素甲对K562细胞增殖存在抑制作用。见表1。

2.2 贝母素甲对K562细胞ROS生成的诱导

应用DCFH2-DA荧光探针检测贝母素甲对K562细胞ROS含量的影响。实验结果显示，贝母素甲100、200、400 μmol/L处理组的ROS含量分别为空白对照组的（1.41±0.17）倍、（1.81±0.18）倍和（2.19±0.18）倍。统计学分析表明，贝母素甲可诱导细胞ROS含量上升，差异有统计学意义（P < 0.05），呈现出剂量依赖性。采用ROS清除剂NAC预处理细胞1 h，然后再添加贝母素甲（400 μmol/L）处理，K562细胞ROS含量与对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），而与贝母素甲（400 μmol/L）处理组明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），提示贝母素甲诱导细胞ROS的增加受到NAC抑制。提示贝母素甲可以诱导K562细胞ROS的生成。见图1。

2.3 贝母素甲可引起K562细胞GSH含量的下降

研究结果表明，贝母素甲可以引起K562细胞内GSH含量的显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。100、200、400 μmol/L贝母素甲处理可分别使GSH含量下降至空白对照组GSH含量的（72.01±9.15）%、（64.60±5.29）%和（50.89±3.34）%，具有量效關系。这提示贝母素甲可能抑制K562细胞内GSH生成或促进其消耗，下调细胞内GSH含量。见图2。

2.4 氧化-还原状态的失衡参与贝母素甲对K562细胞增殖的抑制

结果显示，NAC或GSH能有效逆转贝母素甲对K562细胞增殖的抑制。利用NAC清除过多的ROS或是直接补充GSH，可避免细胞内氧化-还原状态的失衡。这提示氧化-还原状态的失衡在贝母素甲对K562细胞增殖的抑制过程中起重要作用。见表2。

3 讨论

浙贝母是临床上常用的化痰药物，具有清热化痰，开郁散结之功效。其中主要活性成分之一贝母素甲的抗肿瘤作用颇受关注[18]。胡凯文等[7]率先报道贝母素甲对人白血病细胞K562具有体外抑制细胞增殖的作用。本研究亦证实贝母素甲可抑制K562细胞增殖与上述文献报道相符。

细胞内正常的氧化-还原状态是其生命活动所必需的。细胞内ROS大量产生或抗氧化防护系统（如GSH）功能的下降，可导致氧化-还原状态的失常，造成细胞氧化损伤乃至死亡。一些抗肿瘤药物通过诱导K562细胞大量产生ROS，下调GSH含量，改变细胞的氧化-还原状态，从而抑制K562细胞增殖，杀伤细胞[10，14，19]。GSH是细胞内的一种重要抗氧化肽。有证据表明，细胞内GSH含量变化与某些药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用相关。郑智等[20]报道复方浙贝母颗粒协同阿霉素可降低人白血病细胞移植瘤组织细胞中GSH含量，抑制抗氧化酶的表达，提高难治耐药性白血病临床缓解率。本研究结果表明，贝母素甲处理可改变K562细胞的氧化-还原状态，具体表现为贝母素甲处理引起K562细胞ROS水平上调，细胞内GSH含量下降。这导致细胞内氧化-还原状态的失衡。在上述工作基础上，本研究进一步采用ROS清除剂NAC（5 mmol/L）或GHS（5 mmol/L）预处理K562细胞1 h，再给予贝母素甲（400 μmol/L）干预24 h，随后进行MTT检测，分析氧化-还原状态失衡与贝母素甲对K562细胞增殖抑制的相关性。ROS清除剂NAC的预处理和GSH的补充几乎完全消除了贝母素甲对K562细胞增殖的抑制。这些结果说明贝母素甲引发细胞内氧化-还原失衡可能是其抑制K562细胞增殖，具有体外细胞毒作用的重要机制。

综上所述，本研究发现贝母素甲能抑制K562细胞增殖。在这一过程中，贝母素甲调节了K562细胞内ROS和GSH含量，破坏其氧化-还原平衡。活性氧清除剂NAC和GSH的处理能抑制贝母素甲的上述效应，提示氧化-还原状态影响贝母素甲对人白血病细胞K562增殖的抑制作用。

[参考文献]

[1] 卓诗勤，张浩，丁弋娜，等.硫熏和鲜切浙贝母的化学成分及其药理作用的比较研究[J].中华中医药学刊，2016， 34（3）：618-621.

[2] 黄长煌.蒸发光散射测定浙贝母中贝母素甲、贝母素乙的含量探究[J].中国卫生标准管理，2016，7（18）：139-141.

[3] 谌海燕，陈信义.贝母素甲抑制人乳腺癌细胞-增殖及其对细胞凋亡的影响[J].中医药学报，2012，40（4）：12-15.

[4] 王冰，宋锐，牟宗玲，等.中药逆转肿瘤多药耐药的相关研究[J].中医学报，2016，31（7）：946-948.

[5] 刘韦鋆，邹富胜，李东华.浙贝母抑制耐药肿瘤P糖蛋白的活性组分研究[J].中国中西医结合外科杂志，2015，22（4）：379-382.

[6] 唐晓勇，唐迎雪.浙贝母碱对肺癌细胞多药耐药的逆转作用观察及机制探讨[J].山东医药，2012，52（18）：4-6.

[7] 胡凯文，郑洪霞，齐静，等.浙贝母碱逆转白血病细胞多药耐药的研究[J].中华血液学杂志，1999，20（12）：33-34.

[8] 李冬云，陈信义，姜靖雯.复方浙贝颗粒研究现状与应用前景分析[J].中国药物与临床，2009，9（2）：85-87.

[9] 陈俊宇，李俊玮，梁源，等.活性氧：肿瘤进展的双刃剑[J].中国实验诊断学，2016，20（9）：1598-1600.

[10] Song W，Hu P，Shan Y，et al. Cartilage polysaccharide induces apoptosis in K562 cells through a reac，ve oxygen species-mediated caspase pathway [J]. Food Funct，2014， 5（10）：2486-2493.

[11] 段坦然，孟春春，唐兆新，等.活性氧在肿瘤发展和治疗中的作用[J].中国细胞生物学学报，2016，38（10）：1295-1301.

[12] 杨梦祺，刘盼盼，黄蓬.肿瘤氧化还原代谢与干预[J].中国生化药物杂志，2016，36（9）：16-23.

[13] Landry WD，Woolley JF，Cotter TG. Imatinib and Nilotinib inhibit Bcr-Abl-induced ROS through targeted degradation of the NADPH oxidase subunit p22phox [J]. Leuk Res，2013，37（2）：183-189.

[14] Khoshtabiat L，Mahdavi M，Dehghan G，et al. Oxidative stress-induced apoptosis in chronic myelogenous leukemia K562 cells by an active compound from the dithio-carbamate family [J]. Asian Pacific J Cancer Prev，2016，17（9）：4267-4273.

[15] 王海娟，张美芝，刘小菊，等.雷公藤内酯醇逆转肿瘤多药耐药研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（10）：229-234.

[16] Ak？觭akaya H，Tok S，Dal F，et al. β-carotene treatment alters the cellular death process in oxidative stress-induced K562 cells [J].Cell Biol Int，2017，41（3）：309-319.

[17] Yao JY，Wei X，Lu YH.Chaetominine reduces MRP1-mediated drug resistance via inhibiting PI3KAktNrf2 signaling pathway in K562Adr human leukemia cells [J]. Biochem Bioph Res Co，2016，473（4）：867-873.

[18] Xiao R，Cui WX，Yang L，et al. Extraction of total alkaloids，peimine and peiminine from the flower of Fritillaria thunbergii Miq using supercritical carbon dioxide [J]. J CO2 Utiliz，2017，18（2）：283-293.

[19] Zhang J，Cao M，Yang WW，et al. Inhibition of glucose-6-phosphate dehydrogenase could enhance 1，4-benzoquinone-induced oxidative damage in K562 cells [J]. Oxid Med Cell Longev，2016，2016（21）：1-11.

[20] 鄭智，侯丽，许亚梅，等.复方浙贝颗粒联合阿霉素影响K562/A02移植瘤细胞耐药相关酶表达研究[J].医学研究杂志，2009，38（12）：29-31，146.