法舒地尔对肺动脉高压血管重塑中ROCK及ET—1活性的影响

陈小军+邢银花+陈其章+王红娟

【摘要】 目的 探讨法舒地尔对肺动脉高压（PAH）血管重塑中ROCK及内皮素-1（ET-1）活性的干预作用。方法 42只大鼠， 随机分为空白对照组（C组， 7只）、PAH模型组（P组， 7只）、生理盐水组（NS组， 14只）、法舒地尔组（ROCK组， 14只）。注射野百合碱建立大鼠肺动脉高压模型， ROCK组于第28天开始注射法舒地尔， 治疗4周；P组无干预；NS组注射生理盐水。干预结束后测量、观察各项指标。结果 ROCK组和指标与其他组相比， 干预效果明显较好（P<0.05）。结论 法舒地尔在肺动脉高压血管收缩和重建中可有效抑制ROCK， 并降低ET-1活性， 有效降低肺动脉压力。

【关键词】 法舒地尔；肺动脉高压；血管重塑

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.21.159

PAH是心血管常见疾病之一， 是因为肺血管的增生及重构导致肺血管阻力进行性增高的致命性疾病。以往研究证明ROCK信号通路参与了肺血管的收缩和重建， 但是PAH确切的发生机制尚未完全明确。本研究力求进一步明晰法舒地尔在肺血管的收缩和重建中的作用和作用机理， 提高对肺动脉高压发病机制的理解， 希望能为预防和治疗肺动脉高压提供临床依据。

1 材料与方法

1. 1 材料 清洁级健康雄性Sprague—DaWley大鼠42只， 体重180～248 g， 适应性喂养7 d后， 随机分为C组7只、P组7只、NS组14只、ROCK组14只。

1. 2 肺动脉高压动物模型的建立及干预 将野百合碱（Sigma公司， 美国）溶解于1 mol/L稀盐酸溶液， 以1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH7.2， 最后用生理盐水配制成1%溶液， 在大鼠头颈部皮下一次性注射野百合碱50 mg/kg。4周后野百合碱诱导的肺动脉高压模型建立成功， 即P组；C组给予普通饲料喂养， 自由进食饮水。NS组于腹腔注射等体积生理盐水， 直至第8周末；ROCK组于第28天开始腹腔注射法舒地尔（日本旭化成制药株式会社， 国药准字H20050331， 产品生产批号：ERSllMM）15 mg/（kg·d）至第8周末。

1. 3 方法 ①大鼠肺动脉平均压（mPAP）的测定：注射野百合碱后第4、8周末各自停止用药2 d， 以10%水合氯醛30 ml/kg

腹腔内注射麻醉， 采用右心导管测压方法经右颈外静脉插管至肺动脉和右心室， 肝素化后用RM-6240B/C多导电生理记录仪（成都仪器厂）测定mPAP；②组织学观察：留取肺组织， 备提取蛋白。固定于10%中性福尔马林溶液中2 d， 常规处理， 备用于HE染色和ROCK蛋白免疫组化。测定直径75～150 μm的肺动脉血管壁厚度占血管外径的百分比（WT%）及管壁面积占血管总面积的百分比（WA%）；③免疫组化分析肺组织中ROCK蛋白表达；④提取蛋白及免疫印迹（Western blot）半定量分析ROCK-1、pMYPT-1及MYPT-1蛋白表达；⑤半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测mRNA表达。

1. 4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

①大鼠基本情况：大鼠于注射野百合碱后第21天左右逐渐出现进食、饮水减少、毛发枯燥、体质下降、活动减少等症状， 至第8周末情况更加严重， 甚至出现右心衰竭和死亡。实验结束后， C组、P组大鼠均存活， NS组存活4只（4/14）， ROCK组存活11只（11/14）。ROCK组与NS组相比， 动物死亡比率较低（P<0.05）， 大鼠基本情况明显较好。②mPAP：注射野百合碱后第4周末， C组为（20.3±1.8）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）， P组为（36.2±2.4）mm Hg， P组显著高于C组（P<0.05）， 表明肺动脉高压建模成功。第8周末， NS组为（39.7±1.8）mm Hg， ROCK组为（26.2±2.3）mm Hg， NS组进一步高于P组， 但ROCK组显著低于NS组（P<0.05）。③大鼠肺小动脉形态学观察：C组、P组、NS组、ROCK组WT%分别为（13.3±3.4）%、（25.6±5.3）%、（28.2±4.4）%、（15.6±2.8）%；WA%分别为（38.4± 2.8）%、（60.3±2.5）%、（68.8±1.6）%、（40.3±2.8）%。C组大鼠肺小动脉血管内皮细胞连续、均匀的分布， 大小一致， 厚薄一致， 血管壁没有增厚， 血管腔没有狭窄。P组内皮细胞连续性变差， 中层平滑肌细胞肥大、排列混乱， 血管腔狭窄明显， WT%与WA%明显高于C组， NS组进一步高于C组， ROCK组明显低于NS组（P<0.05）， 病变较轻。④ROCK-l蛋白表达水平：C组阳性信号指数（7.2±0.1）， P组为（17.4±0.2）， NS组为（20.6±0.2）， ROCK组为（12.3±0.1）。P组和NS组ROCK-l蛋白表达水平明显高于C组， 但ROCK组表达水平明显低于NS组（P<0.05）。⑤mRNA表达：C组mRNA表达量为（1.1±0.2）， P组为（1.6±0.1）， P组显著高于C组， NS组为（1.6±0.3）， ROCK组为（1.2±0.1）， ROCK组显著低于NS组（P<0.05）。⑥ET-1活性：C组、P组、NS组、ROCK组ET-1分别为（1.1±0.3）、（1.8±0.2）、（2.3±0.6）、（1.9±0.3）， P组较C组明显升高， NS组进一步高于P组， 但ROCK组较NS组显著下降。

3 讨论

野百合碱可引发肺血管重构和内膜损伤， 导致PAH， 与人类PAH发病机制相似， 由其引发的PAH大鼠是比较理想的动物模型。野百合碱诱发的PAH大鼠ROCK-1蛋白表达显著增多， 且比肺动脉内皮细胞上表达要多， 血管壁厚度增加， 管腔更狭窄， 本研究发现， 法舒地尔治疗肺动脉高压可使大鼠mPAP 降低， 右心室肥厚减轻， ROCK-l蛋白表达水平下降， 通过抑制ROCK-l活性， 平衡内皮细胞合成分泌ET-1水平， 进一步增强内皮介导的血管重建效应， 改善血管持续收缩， 改善PAH症状。

综上所述， 法舒地尔在PAH血管收缩和重建中可抑制ROCK， 并降低ET-1活性， 有效降低肺动脉压力， ROCK信号传导通路的研究将成为PAH发病机制研究的新方向。

参考文献

[1] 吴文汇， 张锐. 法舒地尔治疗肺动脉高压研究. 临床药物治疗杂志， 2011， 9（1）：21-25.

[2] 张莹洁. 法舒地尔对野百合碱诱导兔肺动脉高压的影响. 河北医科大学， 2012.

[3] 张颖， 靳春妍， 刘红艳， 等. 法舒地尔治疗肺动脉高压疗效的Meta分析. 现代药物与临床， 2015（6）：726-731.

[收稿日期：2016-04-28]