柑橘素预处理对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用

孟利敏++++++吴绍华++++++席树强++++++杨红亮++++++张翼

[摘要] 目的 探讨柑橘素预处理对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用。 方法 56只SD雄性大鼠，随机分为正常对照组（CON）、柑橘素1、2.5、5、10、20、40 μmol/L组（NARI）。各组大鼠心脏平衡灌流30 min后，对照组给予30 min全心缺血和60 min再灌注处理（或120 min用于测定心肌梗死面积），NARI组大鼠缺血前分别给予1、2.5、5、10、20、40 μmol/L Nari灌流10 min预处理，再行30 min全心缺血和60 min再灌注处理（或120 min用于测定心肌梗死面积）。观测各组大鼠左心室舒缩功能，测定心肌乳酸脱氢酶含量、心肌超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量，并计算心肌梗死面积百分比。 结果 与CON组相比，2.5 μmol/L及以上浓度NARI預处理组大鼠缺血/再灌注后心功能恢复提高、乳酸脱氢酶含量降低和心肌梗死面积减少，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与对照组相比，2.5 μmol/L及以上浓度NARI组大鼠心肌SOD活力明显增加，MDA含量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 柑橘素对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤具有保护作用，其作用机制可能与增强心肌对缺氧的适应能力相关。

[关键词] 柑橘素；心脏保护；缺血/再灌注；抗氧化

[中图分类号] R541 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0020-05

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of naringenin on myocardial ischemia/reperfusion injury in isolated rat hearts. Methods 56 SD rats were randomly divided into： normal control （CON） group， naringenin （NARI） of 1， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L groups. After balance perfusion for 30 min in each group， CON group was treated with 30 min global ischemia followed by 60 min reperfusion （or 120 min for determination of the infarct size）. The NARI rats hearts were pretreated with 1， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L Nari perfusion for 10 min before ischemia， and then 30 min global ischemia and 60 min reperfusion （or 120 min for determine the infarct size）. The left ventricular function was obseved； levels of myocardial lactate dehydrogenase， myocardial superoxide dismutase （SOD） activity and malondialdehyde （MDA） were measured； and the percentage of myocardial infarct size was calculated in each group. Results Compared with the CON group， the recovery of heart function was increased， the content of lactate dehydrogenase and the area of myocardial infarction were decreased after ischemia/reperfusion in 2.5 μmol/L and above NARI pretreatment group （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the control group， the SOD activity of myocardium significantly increased and the content of MDA significantly decreased in 2.5 μmol/L and above NARI pretreatment group（P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Naringenin has protective effect for isolated rats hearts with ischemia/reperfusion injury， its mechanism may be associated with enhanced myocardial antioxidant capacity.

[Key words] Naringenin； Cardiac protection； Ischemia/reperfusion； Antioxidation

缺血性心脏病是临床常见的心血管疾病，其中最严重的是急性心肌梗死，其发病率和病死率逐年上升。临床上常用的治疗方法是血运重建术，可以迅速恢复缺血区心肌供血，挽救濒死心肌[1]。再灌注治疗是一把“双刃剑”，在恢复心肌供血带来有益效果的同时，会加重心肌缺血所造成的损伤，并且为不可逆性，称之为缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion），表现为心脏血流动力学改变、心肌酶释放、心肌组织结构改变等[2]。

柑橘素（Naringenin，Nari），又称柚皮素，是一种天然存在的黄酮类物质，广泛分布于葡萄柚、柠檬、番茄等植物中。研究发现，柑橘素具有多种生物学和药理学特性，比如抗氧化、抗炎、抗血栓形成、抗癌、止血、抗溃疡形成等[3-9]。有报道，柑橘素对糖尿病、大鼠脑神经缺血损伤具有保护作用[9]。Subburaman等[10]研究发现，利用阿霉素的毒性所致的心肌损伤大鼠模型中，柑橘素有心脏保护作用。但是，柑橘素对心肌缺血/再灌注损伤是否具有保护作用尚不清除。本研究应用Langendorff离体心脏灌流技术，建立大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤模型，通过柑橘素预处理，探讨柑橘素对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤是否具有保护作用以及可能的机制，为研究新的缺血/再灌注损伤药物提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 实验动物

成年雄性Sprague–Dawley大鼠56只，体重260～310 g[河北医科大学动物中心提供，合格证号SCXK（冀）2013-1-003]。按照随机数字表法分成7组：对照组（CON）、柑橘素组（NARI）1、2.5、5、10、20、40 μmol/L，每组各8只。

1.2 药物与试剂

柑橘素购自美国Sigma公司。柑橘素溶液：柑橘素溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成母液，4℃保存，实验前用灌流液稀释至所需浓度。

乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、TTC试剂、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒购于自南京建成生物工程研究所。其他试剂为国产分析纯。

K-H灌流液：NaCl 118.3 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L。

1.3 离体心脏灌流技术和心脏血流动力学检测

依据传统大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型的实验方法[11]，大鼠行腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，背位固定，开胸，迅速取出心脏，分离主动脉，将充满K-H液的主动脉套管插入主动脉，结扎固定，连接于Langendorff灌流装置，以氧饱和的K-H液恒压恒温逆向灌流。灌流压力90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。离体心脏经过30 min平衡灌流后给予30 min停灌即全心缺血，缺血期离体心脏浸泡在37℃恒温灌流液中，之后恢复60 min或120 min再灌注（用于测定心肌梗死面积）。

左心室内压力通过压力换能器输入记录系统，通过运行Chart程序完成信号自动采集。通过计算机测定的心脏血流动力学指标，包括：左室发展压（LVDP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室压力最大上升和下降速率（±LVdp/dtmax）和冠脉流量（CF）。

NARI组大鼠心脏在平衡灌流30 min后分别给予1、2.5、5、10、20、40 μmol/L的Nari灌流10 min预处理；后再行停灌30 min，复灌60 min或120 min。

1.4 冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）含量测定

收集心脏再灌注后10、20、30、60 min的冠脉流出液，冻存于-80℃待测，采用比色法利用分光光度计按照乳酸脱氢酶试剂盒说明书方法测定LDH含量。

1.5 测定心肌组织匀浆中的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量

灌流结束后，取出心脏，剪下约0.1 g心肌组织，速冻后置-80℃冰箱中保存。测定前取出心肌标本，制成10%匀浆，匀浆低温离心后取上清液行生化检测，按照试剂盒说明书操作，采用酶标仪测定。

1.6 心肌梗死面积测定

实验结束后，迅速取心脏，将心室切成厚薄均匀的5片。放入37℃ 10%TTC溶液中避光15 min，用蒸馏水中止反应，甲醛固定2 h。未受损心肌组织染色为红色，梗死区域呈苍白色。相机拍照，采用图像分析软件分析。心肌梗死面积用梗死区面积占心室面积百分比表示。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柑橘素对大鼠离体心脏血流动力学指标的影响

平衡灌流条件下，各组大鼠心脏的血流动力学指标差异均无统计学意义（P > 0.05）。缺血/再灌注处理后，LVDP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax、CF均明显下降，LVEDP升高。相比CON组，Nari组（10 μmol/L）大鼠心脏血流动力学参数变化较小，缺血再灌注时Nari组大鼠心功能恢复增加（P < 0.05或P < 0.01）。见图1。

心脏缺血再灌注后，2.5、5、10、20、40 μmol/L Nari预处理组大鼠心脏LVDP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax、CF恢复明显高于CON大鼠，而LVEDP明显低于CON大鼠心脏（P < 0.05或P < 0.01）。不同浓度Nari组对心功能影响呈现剂量依赖关系，高浓度效果最好。说明Nari预处理对缺血再灌注后心功能损伤有保护作用。见图2。

2.2 柑橘素对冠脉流出液中LDH的影响

再灌注60 min时，2.5、5、10、20、40 μmol/L Nari预处理组冠脉流出液中LDH含量均明显低于CON组（P < 0.05或P < 0.01），并呈一定量效關系，说明柑橘素可能通过稳定心肌细胞膜，减少心肌酶释放，发挥心脏保护作用。见图3。

2.3 柑橘素对心肌梗死面积的影响

心脏缺血/再灌注后120 min，2.5、5、10、20、40 μmol/L Nari预处理组心肌梗死面积均低于CON组（P < 0.05或P < 0.01），见图4A（封三）。通过TTC染色，不同浓度Nari预处理组心肌梗死白色区域面积（灰白色）均有所减小，尤其以40 μmol/L Nari组梗死面积最小，与CON组间差异显著，见图4B（封三）。

2.4 柑橘素对心肌SOD活性和MDA含量的影响

心脏缺血/再灌注后，与CON组比较，2.5 μmol/L及以上Nari预处理组大鼠心肌SOD活性明显升高，MDA含量明显降低，并呈一定量效关系，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），见图5。表明Nari可以提高心肌对缺氧的适应能力。

3 讨论

缺血心肌恢复血液灌流后常导致心肌缺血加重，出现再灌注损伤。由于缺血缺氧，部分心肌出现坏死，缺血区心肌能量代谢紊乱，心肌收缩不协调，顺应性下降，造成心肌收缩和舒张功能下降，代表左室收缩和舒张功能的血流动力学指标：LVDP和±dp/dtmax降低，心率下降，而LVEDP升高。本研究发现，NARI组大鼠缺血/再灌注后较CON组相比，LVDP、±LVdp/dtmax降低，LVEDP升高（P < 0.05或P < 0.01）。说明柑橘素可以改善缺血/再灌注心脏收缩及舒张功能。冠脉循环血流量代表心脏本身血液供应，与血管本身阻力及心肌舒缩有关，是心功能的另一种体现[12]。本研究显示再灌注后，Nari预处理组较CON组冠脉流量升高，也说明柑橘素可以改善心脏缺血/再灌注后心肌损伤。研究结果同时提示高剂量组柑橘素的心脏保护作用更明显，说明此保护作用具有浓度依赖性。

心肌缺血/再灌注损伤发生时，氧自由基聚集、Ca2+超载、线粒体损伤可通过不同途径导致心肌细胞坏死和凋亡，坏死心肌细胞释放胞内酶入血，使血清内心肌标志物CK-MB、AST、LDH等升高，导致心肌梗死发生[13]。通常认为心肌梗死面积是影响和决定心功能的关键因素，影响預后[14]。本研究显示，与对照组相比，Nari预处理组缺血/再灌注后心肌中LDH含量降低，心肌梗死面积明显降低，尤其以高剂量组明显，表明Nari预处理可能通过改善微循环和交感神经活性，抑制细胞凋亡等途径，对抗缺血/再灌注损伤，减少心梗死面积，具有保护心肌作用。

氧自由基是造成心肌细胞损伤的主要机制之一。SOD是生物体内清除氧自由基的抗氧化酶，其活性反映了机体清除氧自由基的能力。MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，具有生物毒性，其含量可以间接反映自由基损伤程度[15]。当心肌缺血发生时，心肌细胞内氧化呼吸链受到破坏，自由基清除系统被破坏，导致SOD、GSH-Px等自由基的活性降低，大量自由基的堆积使心肌细胞膜的流动性及通透性改变，影响细胞的完整性和功能[16]，引发脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物，最终分解生成MDA，进一步损害细胞膜结构，引起DNA断裂，导致心肌细胞坏死[17-18]。一般通过测定SOD活力和MDA含量的变化以了解心肌的抗氧化能力[19]。因此，测定心肌组织中的MDA、SOD水平反映了心肌对缺氧的适应能力[20]。本实验结果显示，相比CON组，缺血再灌注后NARI组大鼠心肌SOD活力提高，MDA含量降低（P < 0.05或P < 0.01）。表明柑橘素可以通过增加抗氧化酶活性，减少自由基损伤来增强心肌的抗氧化能力以及对缺血/再灌注损伤的耐受程度。有报道，柑橘素通过上调SOD基因表达，增加SOD活性来调节抗氧化能力，发挥保护作用[21]。心肌抗氧化能力的增强可能为Nari抗心肌缺血/再灌注损伤的重要机制之一。

综上所述，柑橘素对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤具有保护作用，可以浓度依赖性改善心脏缺血再灌注损伤，其保护作用可能与清除氧自由基、增强抗氧化酶活性、抑制细胞凋亡有关。研究提出了柑橘素可以作为抗心脏缺血/再灌注损伤的预防用药，为柑橘素的临床研究提供理论支持，今后应从分子、细胞及整体层面进一步探讨其作用及机制。

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