花生四烯酸单乙醇酰胺的酶法制备

王盈盈, 王小三，2, 金青哲, 王兴国

(1.江南大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏无锡214122)

油脂化工

花生四烯酸单乙醇酰胺的酶法制备

王盈盈1, 王小三1，2, 金青哲1, 王兴国1

(1.江南大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏无锡214122)

研究了以花生四烯酸作为酰基供体酶法制备花生四烯酸单乙醇酰胺的方法，其中底物花生四烯酸采用尿素包合法和溶剂低温萃取法二次富集获得。通过单因素试验得到酶法制备花生四烯酸单乙醇酰胺的较佳反应条件为：1 mmol混合脂肪酸(花生四烯酸含量84.68%)与1 mmol单乙醇胺于1.5 mL正己烷体系中混合，在6%(相对于反应物总质量)的Lipozyme 435催化作用下，于50℃、400 r/min条件下反应6 h，可以得到纯度为82.69%的花生四烯酸单乙醇酰胺。

花生四烯酸；二次富集；花生四烯酸单乙醇酰胺；酶法制备

脂肪酸单乙醇酰胺(N-acylethanolamines, NAEs)作为烷醇酰胺类的非离子型表面活性剂，被广泛地应用于洗涤剂、润滑油、化妆品、纺织印染助剂、医药及橡胶工业等[1]。近年来研究发现某些NAEs在动植物组织中还具有独特的生理学功能[2-3]。1992年，花生四烯酸单乙醇酰胺(N-arachidonyl Ethanolamine, Anandamide, AEA)首次被科学家从猪脑中发现并分离确认为内源性大麻素受体的配体物质[4]，AEA通过大麻素系统在体内发挥许多复杂的生理学作用[5]。近年来，越来越多的研究证明AEA在精神分裂症[6]、先兆性流产[7]、肥胖症[8]等许多人体疾病的发生和发展过程中具有关键的作用。若能够在体外合成AEA，将有利于实验室基础性研究，把其作为大麻的有效替代物推向产业化与规模化生产，将带来巨大的社会效益。

高纯度的花生四烯酸(ARA)非常昂贵，降低反应底物ARA的成本是工业化生产AEA亟待解决的问题。相较于利用动植物油脂生产ARA，通过生物技术改造培养特定的微生物或藻类来获取ARA具备更大的优势。故本文的ARA来自于富含ARA的微生物油脂，通过自行富集ARA可以降低AEA的制备成本。常见的多不饱和脂肪酸的富集方法有尿素包合法[9]、低温结晶法[10]、银离子络合法[11]、脂肪酶浓缩法[12]、超临界流体萃取法[13]和分子蒸馏法[14]等。本文采用尿素包合法和溶剂低温萃取法二次富集ARA。

脂肪酸或其衍生物与单乙醇胺(EA)的酶促反应是合成NAEs的一条较优途径[15]。NAEs合成的酰基供体包括脂肪酸、脂肪酸甲酯、脂肪酸酰氯、脂肪酸乙烯酯等，脂肪酸较其他酰基供体，原料更易获得，对生产安全性要求不高。而酶法合成较化学法合成，反应条件更加温和，催化剂易于分离，避免了氧化和产物异构化等导致产生过多副产物。本研究通过从富含ARA的微生物油脂中富集ARA，以纯化的ARA为酰基供体与EA进行酶法合成，优化合成工艺条件，制备较高纯度的AEA。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

富含ARA的微生物油脂(来自Mortierellaalpina)，购自嘉必优生物工程(武汉)有限公司；单乙醇胺；Candidaantarctica脂肪酶(Novozym 435、Lipozyme 435)和Rhizomucormiehei脂肪酶(Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM)，购自诺维信公司；AEA(≥97%)、HMDS+TMCS+Pyridine(体积比3∶1∶9)衍生化试剂，购于Sigma-Aldrich公司；正己烷、异丙醇均为色谱纯；尿素、95%乙醇、己烷、异辛烷、乙酸乙酯、乙腈、醋酸、无水硫酸钠等均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

EL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-4数显恒温水浴锅；DHX-3015低温槽；Re-52型旋转蒸发器；RT10多点磁力搅拌器，德国IKA公司；QGC-12T氮气吹干仪，上海泉岛公司；循环水多用真空泵；Waters 1525高效液相色谱仪(HPLC-ELSD)，Waters公司；Agilent 7820A气相色谱仪，Agilent公司；GC-14B气相色谱仪，岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 混合脂肪酸的制备

根据Wanasundara等[16]的方法制备混合脂肪酸(FFAⅠ)。

1.2.2 花生四烯酸的二次富集

以95%乙醇作为助溶剂，脂肪酸(FFA Ⅰ)与尿素的质量比为1∶2，包合温度为-10℃，包合时间为12 h，即得到一次富集后的ARA(FFA Ⅱ)。

对经过尿素包合法富集后的脂肪酸(FFA Ⅱ)进行二次富集，将FFA Ⅱ(2 g)溶于正己烷(70 mL)中，加入乙腈(30 mL)萃取，剧烈振摇混合溶液，并将其放在-40℃下静置60 min至两相平衡。取下层乙腈层，旋蒸去除溶剂得到二次富集后的ARA(FFA Ⅲ)。

1.2.3 酶法制备花生四烯酸单乙醇酰胺

准确称取二次富集后的ARA样品(FFA Ⅲ)、EA和一定量的有机溶剂于10 mL圆底烧瓶中，在一定温度的水浴中搅拌均匀后加入一定量的固定化脂肪酶，反应一定时间后取样，采用HPLC-ELSD法检测产物中的NAEs。

1.2.4 脂肪酸的组成分析

脂肪酸的甲酯化处理：将约50 mg FFAs与14%的三氟化硼-无水乙醚的甲醇溶液混合，混合溶液于70℃下反应5 min后，加入2 mL正己烷提取脂肪酸甲酯，用于GC分析。检测条件：TR-FAME色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Fisher，USA)；氢火焰离子化检测器(FID)；载气为高纯氮气(99.99%)，燃烧气为氢气和空气；进样口和检测器的温度分别为220℃和250℃；进样口压力0.176 MPa；进样量1 μL，分流比20∶1；氢气流速30 mL/min；空气流速400 mL/min；氮气流速25 mL/min；升温程序为初始温度100℃保持1 min，以5℃/min升温至220℃并保持15 min。通过对比Supelco 37种脂肪酸甲酯混标的保留时间进行定性分析，采用面积归一化法进行定量分析。

1.2.5 脂肪酸单乙醇酰胺的测定

采用HPLC-ELSD法分析酶法催化反应产物中NAEs的含量。检测条件：Sepax HP-Silica色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温45℃；漂移管温度75℃；增益1；进样量5 μL；流动相A相(V正己烷∶V异丙醇=99∶1)，B相(V正己烷∶V异丙醇∶V冰乙酸=1∶1∶0.01)，流速0.8 mL/min；梯度洗脱条件为0～2 min 流动相A由90%降至70%，2～3 min流动相A由70%降至30%，3～10 min流动相A保持30%不变。通过AEA标准品进行定性，并用面积归一化法计算NAEs的含量。

1.2.6 花生四烯酸单乙醇酰胺的测定

采用GC法分析AEA的纯度。检测条件：HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm, Agilent, USA)；氢火焰离子化检测器(FID)；载气为高纯氮气(99.99%)，燃烧气为氢气和空气；进样口和检测器的温度分别为250℃和300℃；进样量1 μL，分流比20∶1；氢气流速30 mL/min；空气流速400 mL/min；氮气流速25 mL/min；升温程序为初始温度140℃保持2 min，以15℃/min升温至245℃并保持2 min, 以5℃/min升温至265℃并保持2 min, 以1℃/min升温至270℃并保持2 min, 以10℃/min升温至300℃并保持5 min。通过AEA标准品进行定性，采用面积归一化法进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 花生四烯酸的制备及富集

富集前后混合脂肪酸的组成变化见表1。由表1可知，富含ARA的微生物油脂经皂化得到混合脂肪酸FFA Ⅰ，其中含有约43.12%的ARA。经一次尿素包合后ARA的含量提高至79.44%，几乎所有的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸均被去除。溶剂低温萃取法可以进一步去除部分一次尿素包合法难以分离的不饱和脂肪酸，从而获得更高ARA含量(84.68%)的混合脂肪酸(FFA Ⅲ)。

表1 富集前后混和脂肪酸的组成变化 %

2.2 花生四烯酸单乙醇酰胺的酶法制备工艺优化

2.2.1 脂肪酶的类型

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)于正己烷(1.5 mL)体系中混合均匀，选择4种商品化脂肪酶在脂肪酶添加量30%(相对于反应物总质量，下同)，50℃、400 r/min条件下搅拌反应。脂肪酶的类型对酰胺化反应酶法制备NAEs的影响如表2所示。

脂肪酶对酰胺化反应催化作用的影响可能与反应底物和有机溶剂的极性大小有关。由表2可知，Novozym 435 与Lipozyme 435对脂肪酸与EA间的酰胺化反应的催化作用相当，两者明显优于Lipozyme RM IM 和Lipozyme TL IM。也就是说反应底物和有机溶剂的极性对Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM的毒性大于Novozym 435和Lipozyme 435。Tufvesson等[17]研究发现Novozym 435在酰胺化反应和酯化反应中均表现出比Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM更好的催化作用。Zoete等[18]也在早期研究中发现来自于C.antarctica的脂肪酶(Novozym 435、Lipozyme 435)对氨气的耐受性要比来自于R.miehei的脂肪酶(Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM)强。这表明反应底物中的EA对Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM的催化活性影响较大。作为Novozym 435的可替代商品化脂肪酶Lipozyme 435，其在酰胺化反应过程中表现出高效的酰胺化催化效率。Wang等[19]首次证实了Lipozyme 435在合成NAEs中突出的催化作用。另外，脂肪酶是一种昂贵的催化剂，较高的成本是制约工业化酶法合成有机化合物的重要因素，考虑到Lipozyme 435的价格成本要略低于Novozym 435，故选择Lipozyme 435作为以ARA和EA为原料酰胺化反应酶法制备AEA的催化剂。

表2 脂肪酶类型对NAEs含量的影响

2.2.2 有机溶剂的种类

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)分别在4种有机溶剂(1.5 mL)体系中混合均匀，在Lipozyme 435添加量30%，50℃、400 r/min条件下搅拌反应。有机溶剂的种类对酰胺化反应酶法制备NAEs的影响如表3所示。

有机溶剂会影响反应体系的黏性大小，反应底物与产物在体系中的溶解度以及脂肪酶的催化活性。该酰胺化反应中，脂肪酸与EA之间的极性差异大，两者相容性差。另外，极性较强的有机溶剂会导致脂肪酶的催化活性降低[20]。Basri等[21]研究表明非极性溶剂能够保持脂肪酶的自然结构，故脂肪酶在非极性溶剂中比在极性溶剂中表现出更好的催化活性。由表3可知，正己烷和异辛烷这两种有机溶剂体系对酰胺化反应作用相当，明显优于乙酸乙酯和乙腈。这表明正己烷和异辛烷可以显著地降低反应体系的黏性和极性。另外，非极性溶剂有利于反应副产物(水)与有机相的分离，促使反应平衡向合成NAEs的方向移动。综合考虑，选择正己烷作为酰胺化反应酶法制备AEA的最适有机溶剂。

表3 有机溶剂的种类对NAEs含量的影响

2.2.3 反应底物的摩尔比

FFA Ⅲ与EA(总质量为0.352 9 g)按照一定的摩尔比在正己烷(1.5 mL)体系中混合均匀，在Lipozyme 435添加量30%，50℃、400 r/min条件下搅拌反应。反应底物摩尔比对酰胺化反应酶法制备NAEs的影响如表4所示。

表4 反应底物的摩尔比对NAEs含量的影响

脂肪酸与EA的摩尔比会影响反应体系的极性和副产物的类型。当脂肪酸与EA的摩尔比大于1∶1 时，则酰胺化反应不充分，副产物中可能会含有酰胺酯。当脂肪酸与EA的摩尔比小于1∶1时，由于EA的强极性作用可能会影响反应底物间的相容性以及脂肪酶的活性。当脂肪酸与EA的摩尔比为1∶1时，产物中主要的副产物为酯胺。当有大量的酯胺生成时，会同时伴有酰基转移现象[17, 22]，由于酰基转移过程速度很快，表征出来的反应为发生了直接酰胺化反应。副产物中的酰胺酯在碱性催化剂作用下，可被EA较快地胺解成醇酰胺，而氨基酯要进一步胺解则比较困难。由表4可知，当脂肪酸与EA的摩尔比为1∶1时，酰胺化反应速率和产物中NAEs的含量都是最高的。故确定合适的脂肪酸与EA的摩尔比为1∶1。

2.2.4 脂肪酶的添加量

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)在正己烷(1.5 mL)体系中混合均匀，在不同的Lipozyme 435 添加量，50℃、400 r/min条件下搅拌反应。脂肪酶的添加量对酰胺化反应酶法制备NAEs的影响如表5所示。

表5 脂肪酶的添加量对NAEs含量的影响

脂肪酶的添加量直接影响酶促反应速率。脂肪酶添加量过低，酰胺化反应过慢，会延长生产时间和影响产品的质量。适当提高脂肪酶用量可以缩短反应时间，但考虑到酶制剂的价格比较昂贵，脂肪酶添加量亦不宜过量。由表5可知，随着脂肪酶添加量的增加，酰胺化反应速率提高。当酰胺化反应进行到4 h时，6%的脂肪酶添加量的催化作用已经达到10%脂肪酶添加量的催化作用。综合考虑，确定合适的脂肪酶添加量为6%。

2.2.5 溶剂的添加量

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)于一定量的正己烷体系中混合均匀，在Lipozyme 435添加量6%，50℃、400 r/min条件下搅拌反应。溶剂添加量对酰胺化反应酶法制备NAEs的影响如表6所示。

表6 溶剂添加量对NAEs含量的影响

溶剂添加量影响反应底物、产物和脂肪酶的溶解度、分散性以及反应底物在反应体系中的浓度。低的溶剂添加量导致低的产物溶解度，高的溶剂添加量则会降低酶和反应物在反应体系中的浓度。由表6可知，当溶剂添加量为1.5 mL，反应进行至4 h时，产物中NAEs的含量达到较高水平。当溶剂添加量继续增加时，NAEs的含量并没有出现大幅度的增加，甚至还出现了下降的趋势。因此，确定1.5 mL正己烷为合适的溶剂添加量。

2.2.6 反应温度和反应时间

FFA Ⅲ(1 mmol，0.291 9 g)同EA(1 mmol，0.061 g)于正己烷(1.5 mL)体系中混合均匀，在Lipozyme 435添加量6%，不同的反应温度，400 r/min条件下搅拌反应。反应温度和反应时间对酰胺化反应酶法制备NAEs的影响如表7所示。

反应温度影响酰胺化反应速率、脂肪酶的活性以及反应底物间的接触机会。升高温度可以改善脂肪酸与EA之间的相容性，提高两者反应过程中的接触机会。另外，在一定的温度范围内，脂肪酶的催化活性随着反应温度的升高而提高，当超过脂肪酶的最适催化温度后，温度的进一步升高反而会降低脂肪酶的催化活性和稳定性，从而影响脂肪酶的循环利用。此外，温度过高还会影响多不饱和脂肪酸的稳定性并导致反应底物EA和有机溶剂的损失，进而影响反应效率。而温度过低则会使反应体系黏性增大从而不利于反应的传质作用。由表7可知，当反应进行至6 h时，酰胺化反应基本平衡。升高温度可以显著地缩短酰胺化反应平衡的时间，当反应温度为70℃或80℃时，产物中NAEs的含量在反应进行至1 h即达到95%以上。但较高的反应温度会导致溶剂的挥发，影响反应底物和脂肪酶的稳定性。当反应温度为50℃时，产物中NAEs的含量从0.5 h的19.66%提高至6 h的97.15%。若继续延长反应时间，则会增大ARA和AEA被氧化的风险，以及加深最终产品的色泽。综合考虑，确定6 h为最适的反应时间，50℃为最适的反应温度。

2.3 花生四烯酸单乙醇酰胺的纯度

通过单因素试验确定合适的AEA的酶法制备工艺条件：1 mmol FFA Ⅲ与1 mmol EA于1.5 mL正己烷体系中混合，在6%的Lipozyme 435催化作用下，于50℃、400 r/min条件下搅拌反应6 h。通过GC法确定AEA的纯度为 82.69%，气相色谱图如图1所示。

图1 反应产物中的AEA的气相色谱图

3 结 论

本文研究表明，以脂肪酸为酰基供体，酶法合成脂肪酸单乙醇酰胺是一条有效的合成途径。采用尿素包合法和溶剂低温萃取法从富含花生四烯酸(ARA)的微生物油脂中二次富集ARA(FFA Ⅲ)。1 mmol FFA Ⅲ(ARA含量84.68%)与1 mmol单乙醇胺(EA)于1.5 mL正己烷体系中混合，在6%(相对于反应物总质量)的Lipozyme 435催化作用下，于50℃、400 r/min条件下反应6 h，经过酶法反应可以得到纯度为82.69%的花生四烯酸单乙醇酰胺(AEA)。作为医药用途的AEA对纯度要求更高，故获得更高纯度的ARA是以脂肪酸和EA为反应底物酶法制备高纯度AEA的关键。此外，除了联合几种合适的多不饱和脂肪酸富集手段外，寻找合适的富含ARA的微生物油脂作为ARA的来源也不失为一个值得考虑的解决方案。

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Enzymatic preparation of arachidonoyl ethanolamide

WANG Yingying1, WANG Xiaosan1,2, JIN Qingzhe1, WANG Xingguo1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2.Collaborative Innovation Center of Food Safety and Quality Control in Jiangsu Province, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

With arachidonic acid(ARA)as acyl donor, the enzymatic preparation of arachidonoyl ethanolamide(AEA)was studied. ARA was enriched by two step enrichment using urea adduct method and solvent extraction method. The optimal reaction conditions of enzymatic preparation of AEA were obtained as follows: 1 mmol mixed fatty acid(ARA content 84.68%)reacted with 1 mmol ethanolamine in 1.5 mL hexane under the catalysis of 6% Lipozyme 435(based on total mass of reaction substrate), 50℃ and 400 r/min for 6 h. Under these conditions, the purity of AEA was 82.69%.

arachidonic acid; two step enrichment; arachidonoyl ethanolamide; enzymatic preparation

2016-07-13；

2016-12-26

江苏省自然科学基金青年基金项目(BK20150137)；江苏省政策引导类计划(产学研合作)前瞻性联合研究项目(BY2016022-33)

王盈盈(1991)，女，硕士研究生，研究方向为油脂及植物蛋白工程(E-mail)yyw_2013@126.com。

王小三，副教授(E-mail)wxstongxue@163.com。

971

A

1003-7969(2017)03-0053-06