超声波辅助SDS反胶束体系前萃米糠蛋白的工艺研究

肖信锦，李阳洋，钟盛华

(1.江西农业大学 理学院，南昌330045; 2.江西农业大学 国土资源与环境学院，南昌330045)

油料蛋白

超声波辅助SDS反胶束体系前萃米糠蛋白的工艺研究

肖信锦1，李阳洋2，钟盛华1

(1.江西农业大学 理学院，南昌330045; 2.江西农业大学 国土资源与环境学院，南昌330045)

利用超声波辅助SDS(十二烷基磺酸钠)/异辛烷-正辛醇反胶束体系萃取米糠蛋白。主要考察了料液比、SDS质量浓度、WO值、超声功率、前萃时间、增溶水pH和KCl浓度对米糠蛋白前萃率的影响。通过正交实验设计优化得到超声波辅助最佳萃取工艺条件为料液比0.015∶1、SDS质量浓度0.08 g/mL、WO值30、超声功率225 W、前萃时间40 min、增溶水pH 7.5和KCl浓度0.25 mol/L。在最佳条件下，米糠蛋白前萃率为86.96%，比常规振荡萃取的高17.14个百分点。

米糠蛋白；超声波辅助；反胶束萃取

在稻谷加工成精米的过程中，除掉外壳外，还会有约占稻谷总质量6%的胚、糊粉层和外层胚乳产生，其混合物称之为米糠，也可称之为“米珍”或是“米粕”[1]。由于加工条件的限制，米糠中会混有少量的果皮、种皮及灰尘等。研究[2-3]表明，米糠富含各种营养物质，新鲜米糠含12%～18%的蛋白质和14%～24%的油脂，此外还含有生育酚、生育三烯酚、脂多糖、谷维素、二十八碳烷醇、α-硫辛酸、角鲨烯、神经酰胺等多种天然抗氧化剂和生物活性物质。根据国家统计局粮食产量公告[4]，我国2016年稻谷产量20 693.4万t，单就米糠中蛋白质与油脂的利用而言，保守估计可提供约160万t米糠油和140万t米糠蛋白，对我国而言是一笔重要的资源与财富。

1989年Leser等[5]成功利用AOT/异辛烷反胶束体系对大豆和向日葵的油脂与蛋白质进行了萃取分离实验。张淑霞[6]、高艳秀[7-8]等对大豆、花生等主要油料作物的萃取分离效果进行了研究，其萃取工艺流程较为成熟，并与超声波和微波等物理方法相结合的研究也有所报道[9]。陈复生等[10]研究发现，通过超声波辅助SDS/异辛烷-正辛醇反胶束体系萃取，大豆蛋白萃取率可提高23%。但利用反胶束体系对米糠油与米糠蛋白同步分离的研究还未见报道。

本研究利用超声波辅助SDS/异辛烷-正辛醇反胶束体系对米糠蛋白进行前萃，研究了料液比(米糠质量与反胶束溶液体积比，下同)、SDS质量浓度、WO值、超声功率、前萃时间、增溶水pH和KCl浓度对米糠蛋白前萃率的影响，通过正交实验设计确定了SDS反胶束萃取米糠蛋白的最佳前萃工艺条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜米糠，由南昌市蒋巷镇长期精制米厂提供；牛血清蛋白，上海蓝季科技发展有限公司；SDS(十二烷基磺酸钠)、异辛烷、正辛醇、十二水合磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、均为分析纯。

AR2140型电子分析天平，HC-200型高速多功能粉碎机，UV755B型紫外分光光度计，DGX-9053B-1 型鼓风干燥器，Hitachi(日立)高速冷冻离心机，K-9860全自动凯氏定氮仪，EM-F2116EB1型微波炉，KS型康氏振荡器，KQ3200DB型数控超声波清洗机。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠预处理

在米糠存储过程中米糠中脂肪酶保持着很高的活性，易造成酸败，因此要对米糠中的脂肪酶进行失活处理。微波稳定法[11]是一种简单易操作的方法。将新鲜米糠粉碎过40目筛后，按4.5 kW/kg在微波炉内处理150 s，使米糠中的脂肪酶失活，后将米糠放入干燥箱中40℃干燥1 h，封口放入冰箱4℃保存。

1.2.2 米糠中主要成分测定

粗蛋白质含量测定，GB 5009.5—2010凯氏定氮法；粗脂肪含量测定，GB/T 14772—2008索氏抽提法；水分含量测定，GB 5009.4—2010灼烧重量法；灰分含量测定，GB 5009.3—2010常压干燥法。

1.2.3 牛血清蛋白标准曲线的制作

通过紫外分光光度法[12]测定前萃液中的米糠蛋白含量，以牛血清蛋白为标准，通过测定不同质量浓度牛血清蛋白标准液在280 nm处的吸光度，以蛋白质质量浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得到y=0.652 3x-0.011 1(R2=0.998 3)。

1.2.4 SDS/异辛烷-正辛醇反胶束溶液的配制

用电子分析天平(精确到0.000 1 g)称取1.6 g SDS粉末，置于100 mL锥形瓶中，加入异辛烷-正辛醇(体积比4∶1)混合液，超声25 min使SDS充分溶解，后加入适量质量浓度的KCl磷酸缓冲液，继续超声10 min，溶液变为澄清透明即为反胶束溶液。

1.2.5 反胶束体系中含水量WO值的测定

采用卡尔费休法[13]，计算公式如下：

WO值=反胶束溶液中增溶水分的摩尔数/反胶束溶液中表面活性剂的摩尔数

1.2.6 SDS反胶束法前萃米糠蛋白工艺流程

取一定量处理的米糠样品于具塞锥形瓶中，按一定的料液比加入SDS反胶束溶液，在超声波辅助条件下进行萃取，完成后转入离心机中4 000 r/min离心10 min，取出静置后取上清液用紫外分光光度计在280 nm波长下以萃取前反胶束溶液为空白测定前萃液中的蛋白质含量。

1.2.7 米糠蛋白前萃率的计算

前萃率=反胶束前萃液中蛋白质质量/(样品加入量×蛋白质含量)×100%

1.2.8 单因素实验

按1.2.6方法，通过控制单一变量，分别研究SDS反胶束前萃米糠蛋白过程中超声功率、料液比、SDS质量浓度、WO值、前萃时间、增溶水pH和KCl浓度对米糠蛋白前萃率的影响。单因素实验中除单一变量外其他影响因素条件不变，控制各因素条件分别为：SDS质量浓度0.08 g/mL、WO值30、料液比0.02∶1、超声功率200 W、前萃时间30 min、增溶水pH 7.0和 KCl 浓度0.25 mol/L。

2 结果与分析

2.1 米糠中的主要组成成分

测得米糠中主要组成成分如表1所示。

表1 米糠主要组成成分 %

从表1可以看出，米糠中粗脂肪和粗蛋白质含量较高，具有进一步开发利用的价值。

2.2 单因素实验

2.2.1 超声功率对米糠蛋白前萃率的影响(见图1)

图1 超声功率对米糠蛋白前萃率的影响

从图1可以看出，米糠蛋白前萃率随着超声功率的增加呈先增大后减小的趋势。这可能是因为超声波所产生的空化效应和机械效应等可以对蛋白质的萃取产生推动作用，通过破碎组织细胞壁和改变蛋白质的空间结构从而促使米糠蛋白更快浸出和进入反胶束溶液中，当超声功率偏小时对米糠蛋白的萃取不够充分，功率过大时又会促使其他非蛋白质物质的溶出，反倒阻碍了反胶束溶液对蛋白质的萃取。因此，选择超声功率为225 W。

2.2.2 料液比对米糠蛋白前萃率的影响(见图2)

图2 料液比对米糠蛋白前萃率的影响

从图2可以看出，米糠蛋白前萃率随着料液比的增加呈先升高后降低的趋势，在料液比0.015∶1处有最优值。这可能是因为反胶束内核中“水池”数量是一定的，溶解蛋白质的能力也有限，米糠样品量过少时萃取的蛋白质的量也很少，但过多的样品加入反而又使蛋白质进入反胶束内核“水池”产生了竞争机制，降低了萃取率。因此，选择料液比为0.015∶1。

2.2.3 SDS质量浓度对米糠蛋白前萃率的影响(见图3)

从图3可以看出，米糠蛋白前萃率随着SDS质量浓度的增加呈先升高后降低的趋势，这主要是因为表面活性剂在有机溶剂中形成反胶束溶液时，存在表面活性剂的质量浓度临界值，低于该临界值时增大表面活性剂的质量浓度可以提高反胶束内核的“水池”数量，溶解更多蛋白质从而提高前萃率，当表面活性剂质量浓度高于该临界值时反胶束内核的“水池”数量已经达到最大值，过高的表面活性剂质量浓度会使溶液黏度增大，反胶束基团与蛋白质分子间的碰撞机会减少，甚至会导致反胶束体系被破坏，不利于蛋白质的提取。因此，选择SDS质量浓度为0.08 g/mL。

图3 SDS质量浓度对米糠蛋白前萃率的影响

2.2.4WO值对米糠蛋白前萃率的影响(见图4)

图4 WO值对米糠蛋白前萃率的影响

从图4可以看出，米糠蛋白前萃率随着WO值的增大呈先升高后降低的趋势。WO值反映了反胶束体系水池中的含水量与水池半径，随着WO值的增大，反胶束体系“水池”也在增大，米糠蛋白更容易萃取进入“水池”中，因此前萃率也增大，但当WO值过大时，反胶束溶液会变得不稳定，导致前萃率下降。因此，选择WO值为25。2.2.5 增溶水pH对米糠蛋白前萃率的影响(见图5)

图5 增溶水pH对米糠蛋白前萃率的影响

从图5可以看出，米糠蛋白前萃率随着增溶水pH的增加呈先升高后降低的趋势，增溶水的最适pH为7.5。一般而言pH通过影响蛋白质表面的电荷状态引起前萃的变化，SDS作为阴离子表面活性剂，形成的反胶束体系只有当水相pH低于蛋白质的等电点时，米糠蛋白才能进入反胶束，而米糠蛋白的等电点为4.5左右，说明米糠蛋白与SDS之间的静电吸引力并非反胶束萃取蛋白质的主要推动力，其萃取动力学机理仍需进一步研究。

2.2.6 前萃时间对米糠蛋白前萃率的影响(见图6)

图6 前萃时间对米糠蛋白前萃率的影响

从图6可以看出，米糠蛋白前萃率随着前萃时间的延长呈先升高后降低的趋势，在前萃10 min时，米糠蛋白前萃率就超过了75%，说明超声波的介入能在短时间内得到较高的前萃率；当前萃时间过长时，前萃率显著下降，这可能是因为超声作用下体系温度会逐渐升高，短时间内可促进分子热运动的增加提高前萃率，时间过长温度过高会导致蛋白质变性，前萃率反而下降。因此，选择前萃时间为40 min。

2.2.7 KCl浓度对米糠蛋白前萃率的影响(见图7)

图7 KCl浓度对米糠蛋白前萃率的影响

从图7可以看出，米糠蛋白前萃率随着KCl浓度的升高呈先升高后降低的趋势，且在KCl浓度为0.25 mol/L 时有最优值，超过该浓度后萃取率迅速下降。KCl溶液作为盐溶液在适当浓度时可以促进蛋白质的溶解以提高前萃率，但是当盐浓度过高时则会造成蛋白质的析出产生“盐析”现象使前萃率下降。因此，选择KCl浓度为0.25 mol/L。

2.3 正交实验优化

在单因素实验基础上，采用正交实验设计对超声波辅助SDS反胶束体系前萃工艺条件进行优化，以米糠蛋白前萃率为考察指标，以单因素实验中的7个因素为考察因素，按L18(37)正交表进行正交实验设计，正交实验因素水平见表2，正交实验设计及结果见表3。

表2 正交实验因素水平

表3 正交实验设计及结果

续表3

实验号ABCDEFG前萃率/%16313231285.6717321312378.1318332123181.56k176.1773.7274.8675.2177.5777.9073.49k280.0277.2281.3781.0077.8679.3282.92k376.5981.8576.5676.5977.3675.5776.38R 3.85 8.13 6.51 5.79 0.50 3.75 9.43

由表3可知，对超声波辅助SDS/异辛烷-正辛醇反胶束体系萃取米糠蛋白前萃率影响顺序依次为KCl浓度>WO值>料液比>超声功率>SDS质量浓度>增溶水pH>前萃时间，萃取米糠蛋白的最优工艺条件为A2B3C2D2E2F2G2，利用对前萃率影响最小的前萃时间作为误差项进行方差分析，得到正交实验方差分析结果见表4。

表4 正交实验方差分析结果

由表4可知，除前萃时间外，KCl浓度、WO值、料液比、超声功率、SDS质量浓度和增溶水pH对米糠蛋白前萃率均影响显著。对最佳工艺条件A2B3C2D2E2F2G2，即SDS质量浓度0.08 g/mL、WO值30、料液比0.015∶1、超声功率225 W、前萃时间40 min、增溶水pH 7.5和KCl浓度0.25 mol/L条件下进行验证实验，米糠蛋白前萃率平均为86.96%。而相同工艺条件下采用常规振荡法得到的米糠蛋白前萃率为69.82%，前萃效果有了明显提高。

3 结 论

通过单因素实验和正交实验优化得到超声波辅助SDS/异辛烷-正辛醇反胶束体系前萃米糠蛋白的最佳工艺条件为SDS质量浓度0.08 g/mL、WO值30、料液比0.015∶1、超声功率225 W、前萃时间40 min、增溶水pH 7.5和KCl浓度0.25 mol/L，该工艺条件下米糠蛋白的前萃率为86.96%，比常规振荡萃取前萃率高17.14个百分点。

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Forward extraction of rice bran protein by SDS reverse micelles assisted by ultrasound

XIAO Xinjin1, LI Yangyang2, ZHONG Shenghua1

(1.College of Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2. College of Land Resources and Environmental Science, Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045, China)

Rice bran protein was extracted using sodium dodecyl sulfonate(SDS)/isooctane-n-octanol assisted by ultrasound. The effects of ratio of material to liquid, mass concentration of SDS, water content(WO), ultrasonic power, forward extraction time, water pH and KCl concentration on the forward extraction rate of rice bran protein were investigated. The results showed that the optimal ultrasound-assisted extraction conditions were obtained by orthogonal experiment as follows: ratio of material to liquid 0.015∶1, mass concentration of SDS 0.08 g/mL, water content(WO) 30, ultrasonic power 225 W, forward extraction time 40 min, water pH 7.5, KCl concentration 0.25 mol/L. Under these conditions, the forward extraction rate of rice bran protein was 86.96%, increasing by 17.14 percentage points than forward extraction rate of common oscillation extraction.

rice bran protein；ultrasound-assist； reverse micelles extraction

2016-07-21；

2016-12-24

肖信锦(1990)，男，硕士研究生，研究方向为生物分离(E-mail)xiaoxinjin073@126.com。

钟盛华，教授(E-mail)zhongsh0805@126.com。

TQ936.2；TS201.1

A

1003-7969(2017)03-0103-05