纳豆杆菌固态发酵花生粕的工艺条件研究

张源洁，胡迎芬，马爱国，王艳平，刘 青

(1.青岛大学医学院，山东 青岛 266021； 2.青岛大学生命科学学院，山东 青岛 266021)

油料蛋白

纳豆杆菌固态发酵花生粕的工艺条件研究

张源洁1，胡迎芬2，马爱国1，王艳平1，刘 青1

(1.青岛大学医学院，山东 青岛 266021； 2.青岛大学生命科学学院，山东 青岛 266021)

以纳豆杆菌固态发酵花生粕产物对DPPH自由基的清除率为指标，考察底物配比、接菌量、料液比、发酵温度和发酵时间对发酵效果的影响，并通过响应面实验确定最佳发酵工艺条件。结果表明最佳发酵条件为：底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麸皮)=7∶1.5∶1.5，接菌量0.3%，料液比10∶3，发酵温度37℃，发酵时间48.7 h。在最佳条件下发酵，上清液40倍稀释液对DPPH自由基清除率达到74.7%，10倍稀释液对羟自由基清除率高达85.2%，表明该条件下制备的发酵产物具有较高的抗氧化活性。

花生粕；纳豆杆菌；发酵产物；工艺条件；抗氧化活性

在我国花生的消耗量巨大，主要用于压榨产油，而后形成大量的花生粕。花生粕中含有人体所需的多种氨基酸，且蛋白质与动物蛋白相近，可消化性高。相比于豆科植物，其胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子含量较少，因此具有很高的营养价值[1]。同时花生肽具有很好的抗氧化作用，研究表明1 mg/mL的花生肽的抗氧化性相当于0.02 mg/mL的VE[2]，因此从花生粕能得到抗氧化活性较高的产物，进而能够清除自由基，达到延缓衰老，预防疾病的目的。

有研究表明经微生物发酵，花生粕中粗蛋白质含量可由原来的48.31%提高到50.58%，必需氨基酸含量可提高16.43%，这表明微生物发酵能提高花生粕的营养品质[3]。花生粕经微生物发酵后抗氧化性能可得到提高，这对提高花生粕的附加值和利用价值具有重要意义。

纳豆杆菌发酵后的产物具有多种有益的功能，如抗氧化、抗肿瘤、降血压及溶血栓等，因此纳豆杆菌是一种极具应用价值的菌种[4-8]。本实验选用纳豆杆菌发酵花生粕，利用微生物在生长过程中产生的蛋白酶来降解底物中的蛋白质，从而得到相应的多肽和氨基酸等活性成分，提高花生粕的抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂

川秀纳豆杆菌(北京川秀公司)，市售花生粕，大豆粕，麸皮，DPPH(美国Sigma公司)，FeSO4、H2O2、水杨酸、无水乙醇、K3Fe(CN)6、FeCl3、三氯乙酸等试剂均为分析纯。

1.1.2 培养基

斜面培养基：NaCl 5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，琼脂粉2 g/L，pH 7.4～7.6，121℃高压蒸汽灭菌20 min。发酵基础培养基：一定质量比的花生粕、大豆粕和麸皮，1.5%的蔗糖，0.4%MgSO4和0.4%CaCl2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.3 仪器

电子天平，HZQ-X100A型恒温振荡器，压力蒸汽灭菌器，离心机，721G可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程

菌种活化→初筛→复筛→选得活性最强的菌株→单因素实验→响应面实验→花生粕最优发酵条件[9]。

1.2.2 单因素实验设计

基础发酵条件：发酵基础培养基，接菌量 0.5%，料液比10∶5，37℃恒温培养24 h。该条件下适当调整进行不同底物配比(m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麸皮)为7∶3∶0、7∶0∶3、7∶2∶1、7∶1.5∶1.5、7∶1∶2)、接菌量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%)、料液比(10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5、10∶6)、发酵温度(29、33、37、41、45℃)、发酵时间(18、24、30、36、42、48、54 h)的单因素实验。发酵结束后，加生理盐水，4℃浸提2 h，3 000 r/min离心30 min，取上清液适当稀释，测定多肽含量(A值)以及DPPH自由基清除率。

1.2.3 响应面设计

在单因素实验的基础上，控制底物配比和料液比，研究发酵时间(A)、发酵温度(B)以及接菌量(C)对发酵产物DPPH自由基清除率的影响。

1.2.4 多肽含量的测定

参照Cotton等[10]方法。

1.2.5 抗氧化活性的测定

羟自由基清除率测定，参照参考文献[11]。DPPH自由基清除率测定，参照Orhan等[12]的方法。铁还原力测定，参照参考文献[13]。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 底物配比对发酵效果的影响(见图1)

注：底物配比1～5分别代表m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麸皮)为7∶3∶0、7∶0∶3、7∶2∶1、7∶1.5∶1.5、7∶1∶2。

图1 底物配比对发酵效果的影响

由图1可见，当底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麸皮)= 7∶1.5∶1.5时，发酵产物中多肽含量(A=0.332)和DPPH自由基清除率(38%)均最高，故最优底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麸皮)为7∶1.5∶1.5。

2.1.2 接菌量对发酵效果的影响(见图2)

图2 接菌量对发酵效果的影响

由图2可见，当接菌量为0.3%时，发酵产物中多肽含量(A=0.35)和DPPH自由基清除率(49%)均最高，故最优接菌量为0.3%。

2.1.3 料液比对发酵效果的影响(见图3)

图3 料液比对发酵效果的影响

由图3可见，当料液比为10∶3时，发酵产物中多肽含量(A=0.382)和DPPH自由基清除率(52%)均最高，故最优料液比为10∶3。

2.1.4 发酵温度对发酵效果的影响(见图4)

图4 发酵温度对发酵效果的影响

不同温度下酶的反应速率不同。一般酶的反应速率随温度升高而增大，生长代谢加快，生产期提前。但酶很容易因温度过高而失去活性，或表现为菌体的衰老，影响最终物质代谢[14]。由图4可见，当发酵温度为37℃时，发酵产物中多肽含量(A=0.39)和DPPH自由基清除率(58%)均最高，故最优发酵温度为37℃。

2.1.5 发酵时间对发酵效果的影响(见图5)

图5 发酵时间对发酵效果的影响

反应体系中纳豆杆菌的数量受发酵时间长短的影响，进而影响基质底物的分解程度[14]。由图5可见，当发酵时间为48 h时，发酵产物中多肽含量(A=0.465)和DPPH自由基清除率(66%)均最高，故最优发酵时间为48 h。

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面实验

在单因素实验的基础上，固定发酵底物配比和料液比，以发酵产物DPPH自由基清除率(X)为指标，研究发酵时间(A)、发酵温度(B)以及接菌量(C)3个因素对发酵效果的影响。因素水平见表1，实验设计与结果见表2。

表1 因素水平

表2 实验设计与结果

2.2.2 响应面方差分析

由统计分析软件Design-Expert 8.0对表2中的实验数据进行二次多项式回归拟合，得到相应预测值与A、B、C3个因素的二次回归方程：

X=74.60+3.95A+3.26B-3.16C-5.43AB+3.82AC+5.10BC-13.90A2-13.73B2-12.23C2

表3为DPPH自由基清除率模型回归与方差分析结果。

表3 模型回归与方差分析结果

2.2.3 响应面交互作用

图6为各因素交互作用对DPPH自由基清除率影响的响应面图。由图6可见，在本实验水平范围内，随着发酵温度的升高，接菌量增加和发酵时间的延长，发酵产物对DPPH自由基的清除率均呈先升高后下降。与单因素实验结果一致。发酵温度和发酵时间、发酵温度和接菌量两因素的交互作用显著。

图6 各因素交互作用对DPPH自由基清除率影响的响应面图

2.2.4 最佳发酵条件的确定与验证

通过对响应面实验模型的分析，得到纳豆杆菌固态发酵花生粕的最佳工艺条件为：底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麸皮)=7∶1.5∶1.5、料液比10∶3、发酵时间48.7 h、发酵温度37℃、接菌量0.3%，DPPH自由基清除率的预测值为75.1%。为验证该实验结果的可靠性，做3组平行验证实验，在最佳发酵工艺条件下进行发酵并测定DPPH自由基清除率平均值为74.7%，与理论预测值相比相对误差在1%以内。表明本实验模型与实际情况拟合较好。

与未发酵的花生粕相比较，发酵前后对羟自由基的清除率分别为6%、85.2%，DPPH自由基清除率分别为4%、74.7%，多肽含量(A值)分别为0.07、0.467，铁还原力(A值)分别为0.063、0.331。可见发酵后花生粕提取物的多肽含量以及抗氧化活性比发酵前增加了几倍到十几倍不等。

3 结 论

纳豆杆菌固态发酵花生粕的最佳工艺条件为：底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麸皮)= 7∶1.5∶1.5，发酵时间48.7 h，发酵温度37℃，接菌量0.3%，料液比10∶3。在最佳条件下发酵，得到上清液40倍稀释液对DPPH自由基清除率74.7%，10倍稀释液对羟自由基清除率高达85.2%，多肽含量(A值)和铁还原力(A值)分别为0.467、0.331，发酵后大大提高了花生粕中多肽和抗氧化物的含量。采用纳豆杆菌固态发酵花生粕为开发具有高抗氧化性的健康食品提供了切实可行的途径，得到的产物有较高的应用价值和意义。

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Solid state fermentation conditions of peanut meal byBacillusnatto

ZHANG Yuanjie1, HU Yingfen2, MA Aiguo1,WANG Yanping1, LIU Qing1

(1.Medical College, Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong, China；2.School of Life Science, Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong, China)

With scavenging rate of solid state fermented peanut meal byBacillusnattoon DPPH free radical as index, the effects of ratio of subtrates, inoculation amount, ratio of material to liquid, fermentation temperature and fermentation time on fermentation result were investigated, and the optimal fermentation conditions were determined by response surface methodology. The results showed that the optimal fermentation conditions were obtained as follows：mass ratio of peanut meal to soybean meal to bran 7∶1.5∶1.5, inoculation amount 0.3%, ratio of material to liquid 10∶3, fermentation temperature 37℃ and fermentation time 48.7 h. Under these conditions, the scavenging rate of supernatant diluted by 40 times on DPPH free radical was 74.7%, and the scavenging rate of supernatant diluted by 10 times on hydroxy radical reached 85.2%, indicating that the antioxidant activity of fermentation product was higher.

peanut meal;Bacillusnatto; fermentation product; process condition; antioxidant activity

2016-07-28；

2016-11-30

山东省科技厅发展规划项目(2014GSF120011)

张源洁(1990)，女，硕士研究生，研究方向为食品卫生与保健(E-mail)370793055@qq.com。

胡迎芬，教授，硕士生导师(E-mail)qingdahyf 2006@163.com。

TQ92；TS201.3

A

1003-7969(2017)03-0099-04