二十二碳五烯酸甲酯标准样品研制

晋文慧，陈晖，张怡评，方华，陈伟珠，洪专

（1.自然资源部第三海洋研究所，福建厦门 361005； 2.华侨大学化工学院，福建厦门 361021）

藻油是一种从海洋微藻中提取得到的天然保健食品，富含ω-3 系高度不饱和脂肪酸（PUFAs），主要包括二十二碳五烯酸（DPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等，以及低含量的二十碳五烯酸（EPA）。DPA 和DHA 都是人体所必需的脂肪酸，但在人体内难以合成，主要来自于海洋鱼类和微藻油，是理想的功效食品或营养品［1-4］。近年来大量实验和临床研究表明，DPA，DHA 对维护人体健康有重要作用，具有调节血脂、软化血管、降低血液粘度、改善视力、促进生长发育和提高人体免疫功能等作用，其中DPA 能清除血液中的低密度胆固醇，预防因胆固醇过多积聚于血管壁而造成的动脉粥样硬化［5-8］。目前，关于PUFAs 的研究多集中在DHA 和EPA，DPA 是DHA 和EPA 合成过程的重要中间物质，因为较难获得DPA 纯净物，且其价格昂贵，所以用纯DPA 进行研究的实验非常少，DPA 还未被系统地研究过。

目前应用的二十二碳五烯酸主要有甘油酯型、甲酯型和游离脂肪酸型。在上世纪90 年代，应用于保健品的类型主要以甲酯型为主，主要的检测方法有液相色谱法、气相色谱法、气质联用色谱法 等［8-12］，但迄今为止，国内尚无研制二十二碳五烯酸甲酯标准样品的报道。为了支持国内相关高校、研究所和生产企业进行研究，进行了二十二碳五烯酸甲酯国家标准样品的制备研究［13］。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：7890 型，配FID 检测器，美国安捷伦科技有限公司；

半制备色谱柱：SB-C18型，250 mm ×20 mm， 5 μm，

红外光谱仪：VERTEX 70 型，德国布鲁克公司；液质联用仪：3100 型，美国沃特世公司；

核磁共振波谱仪：400 MHz 型，德国布鲁克公司；

甲醇、氢氧化钾、硫酸、尿素、硝酸银、无水硫酸钠、丙酮，石油醚：分析纯，沸程为60～90℃，国药集团化学试剂有限公司；

正已烷：色谱纯，美国飞世尔科学世界公司；硅胶：层析用，77～154 m，180℃烘干4 h，烟台芝罘硅胶公司；

硝酸银-硅胶层析柱：自制；

藻油粗品：厦门金达威有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 二十二碳五烯酸甲酯的制备与分装

以藻油粗品为原料，进行皂化反应、尿素包合分离、甲酯化、分子蒸馏，经过硅胶-硝酸银柱层析分离，提纯得到二十二碳五烯酸甲酯粗品，使用SBC18（250 mm ×20 mm，5 μm，安捷伦科技有限公司）半制备色谱柱，采用制备液相色谱技术精制，收集主峰流出液片段，将馏分纯度高于99%的部分合并，于40℃水浴中旋转浓缩至溶剂挥干，再经高真空泵石油醚三级油扩散泵蒸干、残余溶剂去除等过程，获得高纯二十二碳五烯酸甲酯单体［14-15］，于-18℃以下保存备用。

在洁净实验室中，对二十二碳五烯酸甲酯样品进行分装与封装。用1 mL 棕色安瓿瓶进行充氮保护分装，每瓶50 μL，用自动分液器分装，高温封口，共200 瓶，标记为1～200#。分装好的样品置于-18℃冰箱中长期保存，有效期为2 年。

1.2.2 纯度分析

制备质量浓度为1.0 mg／mL 的二十二碳五烯酸甲酯样品溶液，采用气相色谱法进行测定，色谱峰面积归一法进行计算，对二十二碳五烯酸甲酯进行纯度分析［13］。

气相色谱条件：DB-FFAP 型色谱柱（30 m×0.25 mm，0.2 μum，美国安捷伦科技有限公司），柱流量为1.0 mL／min；进样方式为分流进样，进样量为1μL，分流比为1∶10；程序升温设置初始温度100℃，保持5 min，以5℃／min 速率升至220℃，保持20 min；进样口温度为260℃；检测器温度为270℃；载气为高纯氮，流量为1 mL／min，尾吹30 mL／min；燃烧气为氢气，流量为40 mL／min；助燃气为空气，流量为400 mL／min。

1.2.3 结构分析

采用紫外、红外、质谱、核磁进行结构确证。

紫外分析条件：以甲醇为溶剂，样品溶液的浓度为0.5mg／mL，扫描范围为200～400 nm；

红外分析条件：采用KBr 压片液膜法，波数范围为370～7 500 cm-1，分辨率为0.4 cm-1，采样速率为80 张／秒；

MS 分析条件：API 电离源，毛细管电压为3.5 kV，源温度为120℃，脱溶剂温度为350℃，脱溶剂氮气流量为500 L／h，锥孔氮气流量为50 L／h；

NMR 分析条件：溶剂为氘代氯仿（CDCl3），采集1H-NMR 谱和13C-NMR 谱图。

1.2.4 均匀性、稳定性检验与定值研究

根据GB／T 15000.3-2008 《标准样品工作导则（3）标准样品：定值的一般原则和统计方法》［16］进行标准样品稳定性、均匀性检验和定值［17-21］。

均匀性检验：根据“随机抽取的最小瓶数在10和30 之间，而且一般不应少于10”的规定，实验确定抽样数目为15 个，按1.2.2 纯度分析方法，每个样品重复测定3 次，以色谱峰归一化法计算样品的纯度，采用单因素多水平试验方差分析法对二十二碳五烯酸甲酯标准样品进行均匀性检验，计算统计量F值，判断样品均匀性是否良好。

稳定性检验：对二十二碳五烯酸甲酯样品在-18℃条件下，进行24 个月的长期稳定性考察。分别于0，6，12，18，24 个月月末取样，每个样品平行测定3 次，以色谱峰面积归一化法计算样品的纯度值。采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，预测二十二碳五烯酸甲酯的稳定性变化。

定值：选择8 家定值实验室，采用气相色谱峰面积归一法对二十二碳五烯酸甲酯进行联合定值。在1.2.2 气相色谱分析条件下分别随机取3 个样品送检，每个样品平行测试2 次，8 家实验室每家提供6 个数据，对所有测试数据进行统计分析，计算二十二碳五烯酸甲酯标准样品的标准值和不确 定度。

2 结果与讨论

2.1 样品制备及分离纯化

按照1.2.1 方法制备二十二碳五烯酸甲酯单体，制备液相色谱图见图1。从图1 可知，主峰为二十二碳五烯酸甲酯，其保留时间为17.02 min，根据需要，收集主峰流出液，采用气相色谱法进行纯度分析。

图1 二十二碳五烯酸甲酯色谱图

2.2 纯度分析

收集液相色谱法精制后的二十二碳五烯酸甲酯主峰馏分片段，按照1.2.2 采用火焰离子化检测器-气相色谱法进行纯度分析，使用峰面积归一法进行计算。将纯度高于99%的二十二碳五烯酸甲酯馏分进行合并，经过浓缩、抽干、残余溶剂去除等过程，获得高纯二十二碳五烯酸甲酯单体。经气相色谱法分析检测，二十二碳五烯酸甲酯纯度为99.38%，气相色谱图见图2。

图2 二十二碳五烯酸甲酯气相色谱图

2.3 结构确认

采用红外、质谱和核磁等方法对二十二碳五烯酸甲酯进行结构鉴定，化学结构式见图3。红外数据如下：3 012 cm-1为烯烃中=C—H 的伸缩振动，2 932 cm-1为烷烃CH3的不对称伸缩振动，1 740 cm-1为酯键羰基的C=O 伸缩振动，1 171 cm-1为酯键的C—O—C 伸缩振动，710 cm-1为顺式烯烃上C—H 的变形振动，为顺式烯烃的特征峰。样品的红外光谱数据说明结构中存在碳碳双键C=C、酯键、甲基以及顺式碳碳双键等基团。该化合物分子式C23H36O2，相对分子质量为344。测得的准分子离子峰m／z345 ［M+H］+与其相对分子质量相符。在质谱图中，除m／z345 外，还可以见到该化合物脱甲氧基（-O-CH3，31 u）的碎片峰（m／z313），与该化合物含甲氧基的结构相符。样品的核磁共振谱图（1H NMR、13C NMR 等）所给出的结构信息列于见表1，与化合物二十二碳五烯酸甲酯的化学结构式（如图3 所示）相符，确定该样品为二十二碳五烯酸甲酯。

图3 二十二碳五烯酸甲酯的化学结构

表1 二十二碳五烯酸甲酯的核磁共振数据（CDCl3，TMS）

2.4 均匀性检验

按照1.2.4 中均匀性检验方法要求，对15 个二十二碳五烯酸甲酯标准样品进行测定，测定结果列于表2，采用方差分析法对标准样品进行均匀性检验，分析结果列于表3。

表2 二十二碳五烯酸甲酯标准样品均匀性检验结果 %

表3 方差分析结果

根据结果数据进行计算，统计量F=1.868 1，瓶间方差SA2=-0.000 059，瓶间标准偏差ubb=0.01%，实验室内重复性标准偏差Sr=0.02%。经查表可知，F(0.05，14，30)的值为2.04，F

2.5 稳定性检验

按照1.2.4 中稳定性检验方法要求，分别于0，6，12，18，24 个月月末取样，在相对湿度为(60±10)%、温度为(-18±2)℃的条件下，按1.2.2 方法对样品进行稳定性检验，结果见表4。

表4 稳定性试验结果

经计算可得，长期试验稳定性的不确定度贡献度即µlts=0.02%。长期稳定性试验结果表明，二十二碳五烯酸甲酯标准样品在低温密闭环境下纯度值基本恒定，说明二十二碳五烯酸甲酯标准样品于-18℃条件下可稳定保存24 个月。

2.6 定值结果

按照1.2.4 中定值检验方法要求，选取8 家实验室进行定值，定值数据和统计分析结果分别见表5、表6。

表5 定值结果 %

表6 定值方差分析结果 %

由表5 数据计算得二十二碳五烯酸甲酯标准样品的定值结果为99.38%。

取包含因子k=1.96，则扩展不确定度：

通过上述统计学数据处理，确定了标准样品的实验室内重复性标准偏差sr为0.07%，复现性标准偏差sL为0.17%，二十二碳五烯酸甲酯标准样品的特性值定值结果为(99.38±0.20)%（置信度为95%，k=1.96）。

3 结语

建立了二十二碳五烯酸甲酯的制备分离纯化方法，制备得到二十二碳五烯酸甲酯标准样品，对其进行了稳定性、均匀性检测以及定值，其定值结果为99.38 %，置信度95%的扩展不确定度为0.20%。结果表明该标准样品符合国家标准样品的技术规范要求，最终通过国家标样委员会评审，成为国家级标准样品。所研制的二十二碳五烯酸甲酯标准样品填补了国内该领域研究的空白，不仅满足藻类及相关产品分析检测、质量控制工作的需求，也为检测结果的准确性、可比性以及溯源性提供了技术支撑。