丁螺环酮和米安色林对梁氏情境应激箱诱导小鼠焦虑和抑郁样行为的影响

梁 慧，宫 琦，程 涛，梁建辉，

（北京大学1.基础医学院药理学系，2.药学院分子与细胞药理学系，北京 100191）

·论 著·

丁螺环酮和米安色林对梁氏情境应激箱诱导小鼠焦虑和抑郁样行为的影响

梁 慧1，宫 琦1，程 涛2，梁建辉1，2

（北京大学1.基础医学院药理学系，2.药学院分子与细胞药理学系，北京 100191）

目的 设计和建立梁氏情境应激箱，通过观察抗焦虑和抗抑郁药对小鼠行为学指标的影响，评价梁氏情境应激箱对小鼠焦虑和（或）抑郁样情绪反应的诱导作用。方法 梁氏情境应激箱由中央区和3个外周臂构成。ICR小鼠分别ip给予抗焦虑药物丁螺环酮（0.5和1.0 mg·kg-1）和抗抑郁药物米安色林（0.25和0.5 mg·kg-1），观察小鼠首次进入中央区的潜伏期、中央区停留时间、中央区活动路程、外周区活动路程、区域间穿梭次数和总活动度。结果 ①丁螺环酮0.5和1.0 mg·kg-1明显缩短小鼠首次进入中央区的潜伏期，分别缩短了71.9%（P＜0.05）和77.9%（P＜0.05）；剂量依赖性地增加中央区停留时间，各增加了59.5%和73.8%（P＜0.05）；丁螺环酮0.5和1.0 mg·kg-1均可显著减少小鼠区域间穿梭次数（P＜0.05），但对其中央区活动路程、外周区活动路程和总活动度无明显影响；②米安色林0.25和0.5 mg·kg-1明显缩短小鼠首次进入中央区的潜伏期，分别缩短了72.4%（P＜0.05）和82.3%（P＜0.05）；剂量依赖性地增加中央区停留时间，各增加了39.1%和43.9%（P＜0.05）；米安色林剂量依赖性地增加中央区活动路程（P＜0.05）及区域间穿梭次数（P＜0.05），但对外周区活动路程和总活动度无明显影响。结论 梁氏情境应激箱对小鼠焦虑和（或）抑郁样情绪反应具有明确的诱导作用，可作为一个新的焦虑抑郁共病动物模型研究其病理生理机制，筛选和评价新型抗焦虑和（或）抗抑郁药物。

情境应激；焦虑；抑郁；共病现象；动物模型

焦虑和抑郁是2种目前全世界范围内流行最为广泛、发病率最高的情绪障碍，其中任何一种障碍都足以扰乱患者的社交、工作以及家庭生活，甚至出现严重的自伤自杀观念或行为。传统观点一直将焦虑障碍和抑郁障碍视为2个独立的疾病单元，在DSM-V，ICD-10和CCMD-3三个精神障碍分类体系中，二者均有各自明确的诊断标准［1］。然而，流行病学调查显示，焦虑和抑郁共病的情况实则更为常见。在中国焦虑和抑郁的共病率保持在49%～69%［2-3］。在荷兰，约67%的人明确表示近1年内曾被确诊为焦虑和抑郁共病障碍［4］。与单纯的焦虑或抑郁障碍相比，共病患者具有症状顽固［5］、临床表现复杂、病情反复多变、诊断标准不统一、治疗手段缺乏针对性、病程迁延［6］、预后不良［7-8］和复发率高等问题。由此可见，突破传统观点、关注共病障碍并积极开展相关研究工作是非常必要的。然而，就目前的研究现状看，尚无被本研究领域公认的焦虑抑郁共病动物模型。此类动物模型的发展速度和共病研究的实验需求之间存在着极大的矛盾，因此，需要建立一种新的焦虑抑郁共病动物模型。

虽然许多经典的焦虑和抑郁动物模型在相关研究中得到广泛的应用，但是，这些动物模型都存在各自的缺陷。例如，高架十字迷宫及其衍生版本（高架T迷宫和高架O迷宫等）被广泛用于焦虑障碍的相关研究。此类行为学实验的结果虽简单直观，便于测量和统计分析，但易受众多因素影响。在高架十字迷宫实验中，动物大多能够迅速适应实验环境，放弃对开放臂的探索，长时间躲藏于闭合臂中。有时动物会直接从开放臂中逃逸，导致实验失败［9］。强迫游泳实验和悬尾实验属于经典的抑郁动物模型，但应激刺激方式过于剧烈，实验过程中容易对动物的自身活动能力造成伤害，从而降低其模拟临床抑郁症的表面效度和结构效度［10］。旷场实验主要用于观测动物的一般活动度和探索行为，而并非是研究焦虑障碍的特异性实验［11］。长期以来，各个实验室对旷场实验中央区范围的界定都各不相同，导致对同一问题得出不同的，甚至截然相反的结论。此外，还有慢性不可预知性温和应激模型，该模型表面效度和预测效度较高，但实验过程繁复，需长期干预且结果重复性较差［12］。因此，建立和发明针对焦虑和（或）抑郁障碍新的实验方法和动物模型具有十分重要的理论意义和实际应用价值。

情境应激（contextual-stress）是一种公认的焦虑和抑郁障碍的诱发因素，某些特定的场所和环境如迷宫、空旷广场等可以诱发情境应激，产生焦虑、紧张、恐惧、沮丧、厌恶、抑郁、退缩等情绪和行为反应。本研究利用动物探索欲望与警觉回避的心理冲突，设计了一个由3个外周臂和圆形中央区组成的迷宫型实验箱，即梁氏情境应激箱，观察抗焦虑药物丁螺环酮和抗抑郁药物米安色林对梁氏情境应激箱诱导小鼠焦虑样和抑郁样行为的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性ICR小白鼠，体质量20～25 g（华阜康生物科技有限公司），生产许可证SCXK（京）2014-0004，合格证号（11401300032344，11401300032343）。动物房恒温（23～21）℃、恒湿（30～50）%、自然光照，保持12 h昼夜节律（8：00-20：00）。小鼠分笼饲养，每笼4～6只，食水不限。实验开始前，小鼠须在动物房适应4 d以上，定时抓摸以消除应激反应。实验流程遵循美国国立卫生研究院（NIH）实验动物维护和使用指南（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，NIH Publications No.80-23，revised 1996）。

1.2 药物

盐酸丁螺环酮（英国Bristol-Myers公司），生理盐水（河北天成药业股份有限公司），米安色林（美国Sigma公司）。所有药物均以0.9%生理盐水为溶媒，实验当天新鲜配置，腹腔注射体积为10 mL·kg-1。

1.3 仪器

梁氏情境应激箱（图1）由1个圆形（直径30 cm）的中央区和3个形状相同的矩形（长×宽=25 cm× 15 cm）外周臂组成，外周臂等角度（0°，120°，240°）连接于中央区周围。箱体材料为白色聚乙烯板材，四周有高25 cm的外墙围绕。

1.4 动物分组和实验步骤

实验室保持恒温（21～23）℃，恒湿（30～50）%，光照强度为10 lux。所有实验均在14：00到19：00之间进行，避免昼夜节律对小鼠情绪的影响。提前1 h将小鼠移入实验室，以适应环境改变。小鼠背部中央用黑色墨水标记，便于摄像头捕捉其活动轨迹。每只小鼠只使用1次，每次实验结束后需用75%乙醇擦拭梁氏情境应激箱，以消除前1只小鼠遗留的气味干扰。

小鼠分别ip给予丁螺环酮（0.5和1.0 mg·kg-1）、米安色林（0.25和0.5 mg·kg-1）或生理盐水（正常对照），30 min后单独放入梁氏情境应激箱任意外周臂末端，面向中央区，任其自由探索15 min。用西班牙Panlab公司的SMART 3.0系统监测小鼠的活动，并记录：①首次进入中央区的潜伏期：实验开始时，小鼠面向中央区，放入梁氏情境应激箱任意外周臂末端。该指标记录小鼠首次从外周区（3个外周臂面积总和即为外周区）进入中央区的时间；② 中央区停留时间（time spent in central area，CA-time）；③中央区活动路程（distance traveled in central area，CA-distance）；④外周区活动路程（distance traveled in peripheral area，PA-dis⁃tance）；⑤区域间穿梭次数；⑥总活动度：用于描述小鼠在三维空间中的总活动程度，包括爬行、直立、点头、嗅和理毛等行为。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 丁螺环酮对梁氏情境应激箱诱导小鼠焦虑样行为的影响

表1结果表明，与正常对照组相比，丁螺环酮可明显缩短小鼠首次进入中央区的潜伏期（F（2，21）= 5.17，P＜0.05），0.5 mg·kg-1组减少了71.9%，1.0 mg·kg-1组减少了77.9%。丁螺环酮0.5和1.0 mg·kg-1组小鼠中央区停留时间显著延长（F（2，21）=3.91，P＜0.05），分别高于正常对照组59.5%和73.8%，而3组小鼠间中央区和外周区活动路程均无明显差异。虽然丁螺环酮0.5和1.0 mg·kg-1可明显减少小鼠在梁氏情境应激箱中的区域间穿梭次数（F（2，21）=5.43，P＜0.05），但是，对小鼠总活动度的影响无统计学意义。

2.2 米安色林对梁氏情境应激箱诱导小鼠抑郁样行为的影响

表2结果显示，米安色林0.25和0.5 mg·kg-1可使小鼠首次进入中央区的潜伏期明显缩短（F（2，21）= 6.12，P＜0.01），与正常对照组相比分别缩短了72.4%和82.3%；小鼠的中央区停留时间（P＜0.05）由正常对照组的（195±72）s分别延长为（271±57）s和（281±48）s，分别增加了39.1%和43.9%。米安色林在不影响小鼠外周区活动路程的前提下，可显著提高其中央区活动路程（F（2，21）=3.91，P＜0.05），0.25和0.5 mg·kg-1组小鼠分别高出生理盐水组33.3%和43.6%。此外，米安色林还可明显增加小鼠在梁氏情境应激箱中的区域间穿梭次数，0.25和0.5 mg·kg-1分别增加了10.4%和40.1%。统计分析和比较各组小鼠的总活动度，均未见显著差异。

3 讨论

本研究对梁氏情境应激箱诱导小鼠应激反应和行为表现进行了较为系统的、全面的解析，探讨不同行为观察指标的病理生理学意义及其可能的相关药物研发的应用价值。进一步研究发现，抗焦虑药丁螺环酮和抗抑郁药米安色林均可缓解梁氏情境应激箱对小鼠应激反应的诱导作用，对相关的行为观察指标产生明确的药理作用。由此可见，梁氏情境应激箱所诱导的应激反应和行为表现不但存在焦虑情绪反应，同时也包含抑郁情绪表现，值得深入探索。

Tab.1 Effect of buspirone on latency to central area（CA）,CA-time,CA-distance,PA-distance,shuttle number and global activity in ICR mice exposed to Liang′s box

Tab.2 Effect of mianserin on latency to CA，CA-time，CA-distance，PA-distance，shuttle number and global activity in ICR mice exposed to Liang′s box

动物疾病模型的表面效度（face validity）主要是指动物模型各项观察指标的病理生理学意义，以及与临床疾病可能的内在联系［10］。梁氏情境应激箱设定了6个行为学观察指标，从3个维度对小鼠的特定性行为进行了观察和解析。第一，首次进入中央区的潜伏期和中央区停留时间，主要与小鼠的警觉回避有关，反映焦虑和（或）抑郁状态。众所周知，小鼠会本能地回避空旷的，没有遮挡物保护的场所［13-14］。身处陌生环境时，动物一方面在好奇心的驱使下四处游走探索，另一方面则会出于自我保护意识，保持警惕，回避空旷的情境（场所）［15］。在梁氏情境应激箱中，相对外周区而言，中央区显得更加空旷和复杂，容易引起小鼠警觉、回避、焦虑和（或）抑郁情绪反应。同样利用动物的趋近-规避冲突而建立的模型还有许多，例如高架十字迷宫及其衍生版本（高架T迷宫，高架O迷宫）和旷场试验。前者选择动物首次进入开放臂的潜伏期和开放臂停留时间［16］，后者选择动物中央区停留时间［17］来衡量动物的焦虑程度和评价抗焦虑药物的药理作用，它们均与本实验结果相互支持。由此可见，上述行为实验观察指标具有相同的行为医学和精神药理学意义；此外，梁氏情境应激箱对小鼠形成了一种持续存在且无法控制的情境应激刺激，抑制了它的探究习性，小鼠呈现出一系列消极被动的行为反应，习得性无助抑郁模型也正是以此为理论基础而建立的。第二，中央区活动路程和区域间穿梭次数反映小鼠探索新奇环境的欲望和动机，可能与抑郁情绪有关。与经典的旷场实验箱相比较，迷宫型的梁氏情境应激箱就显得更加复杂。因此，封闭的、复杂的、迷宫型的梁氏情境应激箱可能造成小鼠难以“逃避”的情境而产生“行为绝望”，即抑郁情绪。与强迫游泳等行为绝望类抑郁模型相同，在梁氏情境应激箱中小鼠可能会出现明显的行为迟滞、快感缺失症状，其兴趣、欲望和好奇心显著降低，动机性和坚持性下降。第三，外周区活动路程和总活动度主要反映小鼠中枢神经系统的兴奋状态和运动功能。同样，在旷场实验中，通过测定动物的自主活动性，来评价药物对中枢神经系统兴奋水平和运动功能的影响［18-19］。

利用药物明确的抗焦虑或抗抑郁药理作用可以对动物模型的预测效度（predictive validity）作出评价［20］。研究资料表明，丁螺环酮对突触前膜5-HT1A受体具有激动作用，反馈性地抑制神经末梢5-HT的释放，降低中枢5-HT神经系统的功能水平，发挥抗焦虑作用［21］。米安色林属于四环类抗抑郁药［22］，主要通过调节中枢神经系统去甲肾上腺素的含量和释放，产生抗抑郁作用［23-25］。采用上述2种药物对梁氏情境应激箱的预测效度进行评价，结果表明，丁螺环酮和米安色林明显缩短小鼠首次进入中央区的潜伏期，并呈剂量依赖性增加中央区停留时间。抗焦虑药物和抗抑郁药物明确的药理作用帮助小鼠克服了对中央区的恐惧、焦虑情绪，提高了其对新奇环境的敏感度、探究兴趣，说明首次进入中央区的潜伏期和中央区停留时间是评价梁氏情境应激箱诱导小鼠焦虑和（或）抑郁情绪反应重要的行为学指标和参数。与抗焦虑药丁螺环酮减少区域间穿梭次数不同的是，抗抑郁药米安色林明显增加小鼠中央区活动路程和区域间穿梭次数，说明小鼠在药物作用下，处于积极应对、挣扎或逃跑状态，以求摆脱当前的受困局面。这2个行为学指标与抑郁情绪关系更加密切，可能与抗抑郁药增加小鼠探索新奇环境的欲望和动机，增强其对持续应激刺激、挫败和绝望的耐受性有关。必须强调的是，这2个行为学指标更加深入的行为医学和精神药理学意义有待进一步研究。无论是丁螺环酮还是米安色林对外周区活动路程和总活动度均无显著性影响。外周区活动路程，尤其是总活动度主要反映中枢神经系统的兴奋状态。本研究结果说明所选用的药物剂量既未产生非特异性的中枢抑制作用，又未产生明显的中枢兴奋效应。对行为观察指标表面效度和药物作用的预测效度进行综合分析和比较，可以发现梁氏情境应激箱诱导小鼠焦虑和（或）抑郁的表面效度和预测效度具有很好的一致性和相关性，表明梁氏情境应激箱可以用来评价小鼠的焦虑和（或）抑郁情绪反应。

值得注意的是，本研究结果显示，对于首次进入中央区潜伏期和中央区停留时间这两个最为重要的观察指标来讲，不但抗焦虑药丁螺环酮和抗抑郁药米安色林均发挥了明确的药理作用，且显示出基本相同的药理效应，提示梁氏情境应激箱对小鼠情绪应激反应的诱导作用，并非是单一的“心理冲突”诱导焦虑情绪，也可能是难以逃避的“行为绝望”。因此，从动物疾病模型的表面效度和预测效度来讲，梁氏情境应激箱诱导小鼠的情绪障碍更有可能是一种焦虑和抑郁共患疾病动物模型。正如前所述，焦虑和抑郁共病障碍在临床上更为常见。大量临床资料表明，它们具有一系列共同的临床表现［26］、行为特点、遗传背景［27-30］、神经病理生理机制及生物学基础［31］。本项研究工作初步的结果表明，梁氏情境应激箱对小鼠情境应激反应的诱导作用既能够反映抑郁和焦虑情绪各自的变化，又能体现焦虑和抑郁共病的特点，为焦虑抑郁共病病理生理机制的研究和新型抗焦虑和（或）抗抑郁药物筛选和评价提供新的研究手段和思路。

一个信度效度高、重复性好和经济实惠的动物模型对于促进生物医学研究有着十分重要的价值。部分学者积极研究并初步建立了几个焦虑抑郁共病动物模型。比如Pandey等［32］利用金属重物冲击雄性Wistar大鼠头部，造成创伤性颅脑损伤［33-34］，从而建立了创伤性颅脑损伤诱导的焦虑抑郁共病动物模型。然而，由于无法准确控制大鼠的损伤部位、范围、严重程度及预后情况，该动物模型极不稳定。H/Rouen小鼠是一种源于CD1小鼠的新动物品系。在小鼠悬尾实验中，6周龄CD1小鼠静止不动时间＞115 s者被认为是习得性无助小鼠［35-41］。然后，对习得性无助CD1小鼠进行育种和传代，经过40代培育后，获得稳定的新动物品系，命名为H/Rouen小鼠。该品系小鼠可同时表现出焦虑和抑郁障碍的核心症状。但此种动物模型筛选过程繁琐，育种时间漫长，耗时耗力，不适合大规模推广。除此之外，还有以斑马鱼［40］和小鸡［41］等非啮齿类动物为主要实验对象而建立的焦虑抑郁共病动物模型。与上述诸多动物模型比较，梁氏情境应激箱具有以下优势：①低成本、简单易行，无需对实验动物进行长期且复杂的训练；②实验时间短，获得实验结果快速直观；③实验程序规范，实验条件可控性高，结果重复性好；④情境应激源诱导心理应激可以避免手术、电击、禁食、悬尾和强迫游泳等躯体伤害性刺激；⑤与经典的旷场实验箱相比较，梁氏情境应激箱中央区的界定明确和规范，可提高不同研究机构实验数据的可比性。此外，迷宫型梁氏情境应激箱增加情境应激的复杂性和强度；⑥与高架十字迷宫等实验相比较，封闭型梁氏情境应激箱可以防止动物逃逸；⑦梁氏情境应激箱设定6个行为学观察指标，从3个维度对小鼠的特定性行为进行观察和解析，可以全面多角度地评价小鼠在梁氏情境应激箱中的特定行为。

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Effect of buspirone and mianserine on anxiety-and depressionlike behaviors induced by Liang′s contextual-stress box in mice

LIANG Hui1,GONG Qi1,CHENG Tao2,LIANG Jian-hui1,2
(1.Department of Pharmacology,School of Basic Medical Science,2.Department of Molecular and Cellular Pharmacology,School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100191,China)

OBJECTIVE To investigate the effect of anxiolytics and antidepressants on anxietyand/or depression-like behaviours induced by designing a Liang′s contextual-stress box,(Liang′s box) in mice.METHODS Liang′s box was composed of a central area and three peripheral arms.Buspirone (0.5 and 1.0 mg·kg-1)and mianserin(0.25 and 0.5 mg·kg-1)were injected to mice intraperitoneally and the following behavioral indexes were recorded:①latency to the central area(CA),②CA-time,③CA-distance,④distance traveled in the peripheral area(PA-distance)⑤number of the transitions,and⑥global activity.RESULTS①Buspirone 0.5 and 1.0 mg·kg-1decreased the latency to CA by as much as 71.9%(P＜0.05)and 77.9%(P＜0.05),but dose-dependently increased the CA-time by 59.5%and 73.8%(P＜0.05)respectively.Although buspirone 0.5 and 1.0 mg·kg-1obviously reduced the shuttle number(P＜0.05),it did not have significant pharmacological effects on the CA-and PA-distance or global activity.②Mianserin 0.25 and 0.5mg·kg-1decreased the latency to CA by as much as 72.4%(P＜0.05) and 82.3%(P＜0.05),but dose-dependently increased the CA-time by 39.1%and 43.9%(P＜0.05),respec⁃tively.Mianserin enhanced the shuttle number(P＜0.05)and CA-distance(P＜0.05)in a dose-dependent manner,but it had no obvious pharmacological effects on the PA-distance or global activity.CONCLUSION Anxiety-and/or depression-like behaviors can be stimulated by Liang′s box in mice,which may be used as a novel animal model of anxiety and depression comorbidity to study its pathophysiological mecha⁃nisms,screen and evaluate certain new anxiolytics and antidepressants.

contextual stress;anxiety;depression;comorbidity;animal model

LIANG Jian-hui,Tel:(010)82802452,E-mail:liangjh@bjmu.edu.cn

R964

A

1000-3002-（2017）02-0131-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.002

Foundation item:The project supported by National″the 12thFive-Year″Plan for Science and Technology Suport Pro⁃gram(2011BAK04B08)

2016-02-04接受日期：2016-08-26）

（本文编辑：乔 虹）

十二五科技支撑计划项目（2011BAK04B08）

梁 慧，女，硕士研究生，主要从事神经精神药理学研究，E-mail：sophia_lh@sina.cn；梁建辉，男，博士，研究员，博士生导师，主要从事神经精神药理学研究。

梁建辉，E-mail：liangjh@bjmu.edu.cn，Tel：（010）82802452