基于血红蛋白—纳米磷酸钬复合材料的过氧化氢生物传感器

黄海平+徐亮+岳亚锋+吕连连

摘 要 以Ho2O3为反应物，采用水热法制备了纳米磷酸钬（n.HoPO4），并利用场发射扫描电子显微镜（SEM）、能谱分析（EDS）对其进行形貌表征和元素组成分析。将n.HoPO4和血红蛋白（Hb）复合材料修饰于裸玻碳电极（GCE）表面构建生物传感器，实现了对H2O2的电化学检测。采用循环伏安（CV）和电化学交流阻抗（EIS）技术对修饰电极进行表征，结果表明，Hb/n.HoPO4/GCE对H2O2的还原具有良好的电化学催化效果； n.HoPO4具有良好的导电性和生物相容性，促进了Hb与工作电极间的直接电子转移。研究了不同pH值和电化学扫速对修饰电极响应电流的影响。在优化实验条件下，此生物传感器对H2O2在50～1000 μmol/L 范围内表现出良好的线性关系，相关线性系数R=0.999，检出限为17 μmol/L（S/N=3）。此生物传感器具有检测范围宽、稳定性和重现性好、抗干扰能力强等优点，可用于实际样品的检测。

关键词 血红蛋白； 磷酸钬； 过氧化氢； 电催化； 生物传感器

1 引 言

稀土元素独特的4f电子构型，赋予稀土材料优异的光、电、磁性能，在工业催化、燃料电池、荧光材料、生物传感器等领域应用广泛[1～5]。以稀土磷酸化合物纳米材料为例，因其优越的物理化学性质，近年来成为科研工作者的研究热点。Wang等[6]通过水热法制备了不同组成的（Y 0.95Eu 0.05）PO4和 （Y 0.96.xTb 0.04Eux）PO4 （x=0～0.10）晶体纳米片，并详细研究不同组份时的发光性能。Zhang等[7]利用自牺牲模板技术制备了Eu3+掺杂的YPO4空心球，并对不同掺杂条件下产物的荧光性能进行了详细探讨。此外，纳米稀土磷酸化合物具有大的比表面积，稳定性、良好的导电性及生物相容性，因此也被应用在生物传感器领域[1，8]。Zhou等[1]通过水热法在150℃下反应12 h成功合成了LaPO4纳米线，用于生物传感器的构建， 该生物传感器在多巴胺（DA）、尿酸（UA）检测中表现出良好的选择性、宽的检测范围、低的检出限。

磷酸钬（HoPO4）作为一种重要的稀土磷酸盐，制备方法包括高温灼烧法[9]、共沉淀法[10]、结晶法[11]等。HoPO4由于其优异的荧光性能在安全防伪、装饰等领域具有广泛应用。在太阳光和三色光的激发下，HoPO4能发射不同波长的光[10]。通过不同金属离子的掺杂作用，可以改变其晶体结构和荧光性能[11]。但是目前关于HoPO4在生物传感领域的应用，却鲜有报道。

H2O2是一种强氧化剂，被广泛应用在食品加工、消毒液、医药生产等领域。但H2O2的强氧化性会对人体健康造成危害，因此对其含量的分析测定具有重要意义[12～14]。目前对H2O2的检测方法主要有电化学法[15]、荧光分析法[16]、比色法[17]、表面增强拉曼光谱法[18]和电化学发光法[19]等，其中电化学法因具有选择性好、灵敏度高、反应快速等优点得到广泛应用[20]。Guo等[14]制备了基于血红蛋白（Hb）.collagen复合材料的新型H2O2生物传感器，该传感器表现出稳定性好、灵敏度高、线性范围宽等优点。血红蛋白作为一种重要的氧化还原蛋白，对人体内的氧和二氧化碳的存储和运输起着重要作用。血红蛋白拥有丰富的生物催化活性位点，而且价格低廉易得，被广泛的用于构建H2O2生物传感器[21]。然而，血红蛋白作为生物大分子，被直接固定在电极表面时，将阻碍电子的直接转移[22]。为了克服该难题，碳纳米管[23]、石墨烯[24]、普鲁士蓝[25]及各种金属纳米粒子[26，27]等被用于固载生物酶，提高酶与电极间的直接电子转移，进而提高H2O2的检测灵敏度。

本研究结合稀土元素多能级的电子结构、良好的生物相容性等特点，研究稀土纳米材料HoPO4的电化学性能及生物传感应用。首先采用热水法合成n.HoPO4，将其用于固载Hb到玻碳电极表面，从而制备出Hb/n.HoPO4/GCE修饰电极，并研究了修饰电极的电化学行为。n.HoPO4因具有良好的导电性和生物相容性，能够促进Hb与电极间的电子转移。所制备的生物传感器对H2O2具有较宽的检测范围、良好的稳定性和重现性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI660D型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）； 能谱分析（EDS）仪（Philips XL30）、MLA650F型扫描电子显微镜（美国FEI公司）； Autolab PGSTAT12电化学交流阻抗仪（Ecochemie， BV，荷兰）； 电化学测量采用三电极体系，玻碳电极作为工作电极（Φ=4 mm），铂丝电极作为对电极，甘汞（饱和KCl溶液）电极作为参比电极。

壳聚糖（CS）溶液由0.5 g壳聚糖、1 mL冰醋酸、99 mL去离子水混合超声1 h制备，0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）由NaH2PO4， Na2HPO4和 KCl配制，实验所用支持电解液预先通入高纯氮气除氧。2 mmol/L铁氰化钾溶液由铁氰化钾、亚铁氰化钾、KCl配制； 血红蛋白（Hb），H2O2（30%），过氧化氢消毒液（3.0%），Ho2O3，浓HNO3， NaOH，柠檬酸三钠等试剂均为分析纯级，实验用水为去离子水。

2.2 n.HoPO4的合成

根据文献[28]制备YPO4的方法略有改动： 首先称取0.1 g Ho2O3固体粉末于烧杯中，加入去离子水后加热，再缓慢滴加浓HNO3至固体完全溶解后，用一定浓度的NaOH调节溶液pH值至中性。随后将0.5 g柠檬酸三钠和0.1 g NaH2PO4加到上述溶液，在磁力搅拌器下持续搅拌，当溶液开始变浑浊后继续搅拌30 min，再将此溶液移到100 mL聚四氟乙烯反应釜中， 140℃下反应24 h。将所得产物依次用乙醇和去离子水多次洗涤，最后在真空干燥箱60℃下烘干，得到n.HoPO4。

2.3 修饰电极的制备

首先，分别用粒径为0.3 μm和0.05 μm的氧化铝粉末抛光打磨裸玻碳电极成镜面，再用乙醇和去离子水超声清洗后， 置于4℃储存， 备用。将制备好的n.HoPO4用去离子水超声分散获得n.HoPO4溶液（2 mg/mL），同时将2 mg Hb振荡溶于2 mL PBS缓冲溶液（pH 7.0），将制备好的溶液置于4℃储存备用。

分别取20 μL的H2O、n.HoPO4溶液、Hb溶液，充分振荡混合均匀后，取10 μL滴涂在抛光好的裸玻碳电极表面，室温下晾干，再取5 μL CS溶液用于电极表面的封闭，从而制得Hb/n.HoPO4/GCE修饰电极。用同样的方法制备n.HoPO4/GCE修饰电极和Hb/GCE修饰电极，将制备好的修饰电极置于4℃储存， 备用。

3 结果与讨论

3.1 n.HoPO4的形貌表征和组成分析

通过水热法合成的n.HoPO4的SEM图如图1A所示， n.HoPO4的形貌呈六棱柱体，粒径在50～100 nm之间均匀分布。同时对n.HoPO4进行了能谱分析，从图1B和表1可知， 制备的材料由Ho， P， O及Na元素组成，由此可以推断合成的物质主要是HoPO4。

3.2 修饰电极的电化学表征

不同修饰电极的循环伏安曲线如图2A所示，在01 mol/L PBS溶液（pH 7.0）中，n.HoPO4/GCE（曲线b）与裸GCE（曲线a）相比背景电流增大，说明n.HoPO4具有良好的导电性，能促进电子的转移速率； 将Hb修饰在玻碳电极表面后（曲线c），在电0.334 V出现明显的还原峰，这是Hb在PBS溶液（pH 7.0）中的经典还原峰[14]； 而Hb/n.HoPO4复合材料修饰电极的CV图（曲线d）与n.HoPO4/GCE、Hb/GCE相比，有明显的还原峰和更大的还原峰电流值，表明n.HoPO4具有良好的生物相容性，能够保持Hb与玻碳电极间的直接电子转移。为进一步说明HoPO4在H2O2电催化还原中所起的作用，考察了Hb/GCE和Hb/n.HoPO4/GCE修饰电极在含有0.1 mmol/L H2O2的 PBS溶液中的循环伏安行为，与Hb/GCE修饰电极对H2O2的电化学还原电流（曲线e）相比，Hb/n.HoPO4/GCE修饰电极（曲线f）对H2O2的电化学还原具有更大的响应电流。此结果进一步说明n.HoPO4的存在，能有效提升Hb对H2O2的电化学催化效果。

不同修饰电极在2 mmol/L铁氰化钾溶液中的电化学交流阻抗图如图2B所示。在高频区产生的半圆部分反映其界面电子转移过程，半圆直径大小为修饰电极的电子转移阻抗值（Ret）， 直径越大， 其修饰电极的Ret越大； 低频区的曲线部分代表着扩散过程。从图2B可知，在所有修饰电极中，n.HoPO4/GCE的Ret最小，表明其电子转移阻碍性最小，

从而证明了n.HoPO4具有良好的导电性； 而Hb修饰电极的半圆部分最大，说明Hb/GCE的Ret最大，这是由于Hb生物大分子阻碍了电子的转移速率[29]。Hb/n.HoPO4/GCE与Hb/GCE相比，其Ret明显的减小，表明n.HoPO4促进了Hb与玻碳电极间的直接电子转移速率； 与n.HoPO4/GCE相比，其Ret明显更大，表明Hb已经成功地修饰在电极表面。

3.3 pH值对Hb/n.HoPO4/GCE电化学行为的影响

3.6 稳定性和重现性实验

本实验考察了Hb/n.HoPO4/ GCE制备过程的重现性，将制备的3支修饰电极在PBS（pH 7.0）溶液中检测，电化学响应电流的相对标准偏差（RSD）为2.1%，表明修饰电极的制备过程具有良好的重现性。同时考察了修饰电极对H2O2检测的重现性和稳定性，3支修饰电极在含有0.1 mmol/L H2O2的PBS溶液（pH 7.0）中进行检测，电化学响应电流的RSD为3.5%。此外，将修饰电极置于4℃储存10天，在含0.1 mmol/L H2O2的PBS溶液（pH 7.0）中的响应电流仍为初始信号的96%，表明修饰电极对H2O2的检测具有较好的稳定性。

3.7 干扰实验和实际样品回收率

配制含有0.1 mmol/L H2O2， 0.1 mmol/L UA， 0.1 mmol/L AA， 1 mmol/L NaCl， 1 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L葡萄糖的PBS（pH 7.0）溶液，用于考察修饰电极的选择性及抗干扰能力。将制备好的3支Hb/n.HoPO4/ GCE浸在此溶液中检测，与只含0.1 mmol/L H2O2检测的电流值相比，修饰电极的平均响应电流值（RSD=4.6%）仅提高了1.94%。实验表明，此生物传感器具有良好的选择性和抗干扰能力。

选择含3% H2O2的医用消毒液作为实际样品进行检测分析。将消毒液用PBS溶液（pH 7.0）稀释，通过检测其实际H2O2的含量，探讨了该生物传感器的实际应用价值。由表3中可知，H2O2的回收率为100.6%～107.9%，说明此生物传感器可用于医用H2O2消毒液的测定。

4 结 论

利用水热法合成了纳米HoPO4，并将Hb/n.HoPO4复合材料修饰在裸玻碳电极表面，制备得到H2O2生物传感器。n.HoPO4优良的导电性、生物相容性等性能，能够保持Hb的生物活性，并促进Hb与玻碳电极间的直接电子转移。此生物传感器对H2O2的检测表现出线性范围宽、重现性和稳定性好、抗干扰能力强等优点，在实际样品的检测中具有良好的回收率。

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Abstract The nanomaterial of n.HoPO4 was synthesized via hydrothermal method with Ho2O3 as raw material， and its morphology and component were characterized by SEM and EDS. The composite material of n.HoPO4 and hemoglobin （Hb） was dropped onto the surface of the glassy carbon electrode （GCE） so as to construct the biosensor for detection of hydrogen peroxide. The whole process was characterized by cyclic voltammetry （CV） and electrochemical impedance spectroscopy （EIS）. The results indicated that （Hb/n.HoPO4/GCE） possessed good electrochemical catalytic effect towards H2O2 reduction. The n.HoPO4 showed good electrical conductivity and could promote the direct electron transfer rate between Hb and GCE. The effect of different pH value and electrochemical scan rates on the response current of the modified electrode was studied. Under the optimal conditions， the biosensor exhibited a good linear detection range from 50 to 1000 μmol/L （correlation coefficient R=0.999） with the detection limit of 17 μmol/L （S/N=3）. The biosensor showed wide detection range， good stability and reproducibility and strong anti.interference ability， and could be used for real sample detection.

Keywords Hemoglobin； Holmium phosphate； Hydrogen peroxide； Electrocatalysis； Biosensor