基于流动注射光度法的吸光度/留存时间比自动测定过氧化物酶活性方法

李永生　郑巍　高秀峰

摘 要 本研究给出了流动注射分光光度系统（FI-SP）测定酶活性浓度（Ec）的通用公式Ec=kΔA/Δt； Δt是在酶促反应线性响应区域内试样塞的平均留存时间；ΔA为平均留存时间处对应的吸光度； k=nV/（εvL），V为样品注入点到流通池入口之间的管路总容积，n为酶底物与产物的反应摩尔比，ε为产物的摩尔吸收系数，v为注入的酶液体积，L为流通池光程；FI-SP系统确定后k为常数。在此基础上，将H2O2/过氧化物酶（POD）/愈创木酚（GA）反应体系导入FI-SP系统，建立了一种无需标准曲线的POD活性快速准确测定的新方法。此方法优化后的条件：载流磷酸盐缓冲液浓度为0.05 mol/L（pH 5.5），进样体积为40 μL，反应盘管长度200 cm， 1.5 mmol/L H2O2，3.5 mmol/L GA，0.4 mol/L HCl（清洗液），检测波长470 nm，产物的摩尔吸光系数为0.0125 L（μmol ·cm）。本方法的重现性RSD<0.38%（n=11），分析速度为40样/h，测定范围为450～7260 U/L，检出限为89 U/L。在优化条件及60℃下，用本方法测定了多种白萝卜中POD活性，结果与动力学曲线法完全相同。

关键词 流动注射分析；过氧化物酶；萝卜提取液；愈创木酚；过氧化氢

1 引 言

过氧化物酶（POD， EC 1.11.1.7）是一种广泛存在于植物和动物体内的酶，被应用在临床检验[1]、环境监测[2]、有机合成[3]和食品分析[4]等领域，大多数生化试剂盒都含有POD，其最重要的指标就是酶活性。因此，POD活性的快速准确定量尤为重要。POD能催化酚类或胺类显色试剂与H2O2的反应；常用的显色试剂有邻苯二胺[5]、季胺[6]、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）[7]、邻苯三酚[8]、愈创木酚（GA）[9]、以及胺和酚类的耦合物[1，10]。这些显色剂在POD催化下与H2O2反应生成的产物都可通过比色法进行定量，但最常用的显色剂是低毒性、廉价的GA。早先认为H2O2/POD/GA体系的产物是愈创木酚四聚体（4-GA）[9]，但新的研究发现产物是愈创木酚二聚体（2-GA）[11～13]。我们验证了此结果并发现该产物不稳定，会很快分解成其它物质而褪色[14]， 这导致采用手工比色法定量POD活性时得到的结果重现性很差。此外，由于该产物不稳定，难以提纯，所以只能通过反应物GA的浓度间接地求得反应体系中产物2-GA的摩尔吸光系数（ε）[15]，并用此ε值去计算POD活性；但这又会由于ε差异导致得到的POD活性值产生较大的误差。

测定POD活性方法除比色法外[16]， 还有荧光光度法[17，18]和化学发光法[19～21]等。测定POD活性的手工荧光法和化学发光法灵敏度高、线性范围宽；但是，由于POD催化反应的产物激发波长在紫外区，所以被测样品中存在的杂蛋白会对荧光法产生干扰；手工化学发光法的灵敏度虽高但测定结果的重现性较差。流动注射分析（Flow injection analysis， FIA）作为一种自动化分析技术，具有操作简便、分析速度快、精度高等优点[22]，它能与各种检测器组合用于酶活性的自动快速测定[23～25]。Holm[7]用ABTS作为供氢体，利用流动注射光度法对发酵样品中微生物POD活性进行了测定；但此方法的不足之处是ABTS试剂的价格昂贵且稳定性也较差。本研究选择价廉、稳定、且被广泛应用的GA作为供氢体，基于FIA光度法建立了一种新的测定POD活性的分析流路（Flow-injection spectrophotometry for POD， FIA-SP-POD），并对萝卜提取液中的POD含量及活性进行了测定。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

安装10 mm光程流通池的UV-1800PC型紫外/可见分光光度计（上海美谱达）；AUW120D型电子天平（日本岛津公司）；800-1型离心机（常州普天仪器制造有限公司）；JYZ-E6型原汁机（九阳股份有限公司）；FIA-3100流动注射处理仪（北京吉天仪器有限公司）；ASB-200恒温控制器（日本分光株式会社）；CP224S分析天平（德国赛多利斯集团）；pXJ-1C+离子活度计（成都世纪方舟科技有限公司）；SHZ-D循环水式真空泵（郑州金育科贸有限公司）；800B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

GA （国药集团化学试剂有限公司）、HRP（≥250 U/mg， Sigma公司）；实验用水为超纯水（电导率0.065 μS/cm）；其余试剂均为分析纯。新鲜白萝卜购于本地超市。

2.2 萝卜粗酶液制备

称取50 g新鲜白萝卜，切成小块（约1 cm3），置于榨汁机中榨汁，用真空泵将滤渣进行抽滤，合并两次收集的滤液，然后在4000 r/min下离心10 min；最后用针式过滤器（13 mm/0.45 μm）将离心上清液进行过滤；滤液即为粗酶液， 置于冰箱4℃下保存。

2.3 测定原理

2.4 FIA系统及测定过程

FIA-SP-POD系统见图1。测定过程为：当双通道注入阀（V）转至“采样”位置时，酶试样在P1的抽吸作用下充满样品定量环（SL），多余的样品从W2排出，采用P1抽吸采样，可缩短试样流经途径，达到节省试样目的；当此阀转至“注入”位置时，PBS缓冲液载流（C）推动SL中“酶样品塞”进入反应盘管，与反应试剂（R1）汇合，样品塞中的POD催化H2O2/GA反应生成2-GA，流经流通式检测器，给出吸光度信号（A）；试样从注入到产物出现最大吸收峰之间的留存时间为Δt；与此同时，HCl清洗液被P2吸入清洗液定量环（RL），多余的清洗液从W1排出。当此阀再转至“采样”位置时，PBS缓冲液载流（C）推动RL中的HCl清洗液塞，依次进入反应盘管和流通池进行自动清洗，检测器给出基线信号（Ao），两者之差为ΔA（A-Ao）。将此ΔA/Δt代入公式（3）可求得Ec。

3 结果与讨论

3.1 FIA系统参数的优化

基于前期手工法[27]将FIA-SP-POD系统的初始条件设定如下：1.5 mmol/L GA，0.5 mmol/L H2O2，两者等体积混合作为R1； POD样品的注入体积60 μL；0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 5.5）作为载流；0.4 mol/L HCl作为清洗液；P1转速20 r/min （1.73 mL/min），P2转速20 r/min；反应盘管（Φ 0.8 mm）长度为200 cm；背压管（Φ 0.3 mm）长度为50 cm。采用单因素优选法考察了FIA法测定POD活性时的影响因素。

3.1.1 反应盘管最适长度的考察 在FIA-SP-POD系统中，反应盘管长度影响反应进程和分析速度。因此，用白萝卜提取液作为测试样品，考察了RC长度（150， 200， 250， 300和350 cm）对反应产物吸光度的影响。得到的结果表明，RC长度增加，产物吸光度先增大后逐渐减小，RC长度在200 cm 时ΔA最大。其原因是：RC长度较短时反应时间短，导致反应不充分；RC太长时，反应产物的生成速率小于其在管路中被稀释的速率，导致吸光度值缓慢下降。所以本系统的RC选定为200 cm。

3.1.2 试样环最适体积的考察 FIA-SP-POD系统中采样环（SL）的体积即为POD溶液的体积，系统中加入的POD量不同导致酶催化速率不同，进而影响FIA系统的灵敏度，因此，在RC为200 cm的前体下，考察了SL（30， 40， 50， 60和70 μL）对反应产物吸光度的影响。结果表明，SL增加基本上不影响产物吸光度值；

其原因可能是H2O2与GA反应已达到平衡，再增加SL仅仅是酶过量而没有增加反应产物的生成量。考虑到方法灵敏度及节省试样的因素，选定SL为40 μL。

3.1.3 FIA系统基线漂移的消除 研究发现，在FIA-SP-POD系统中H2O2与GA反应所生成的褐色2-GA，容易吸附在流通池中，导致FIA系统的基线漂移。所以，为了减小由于2-GA导致的基线漂移，在FIA系统导入清洗液。即在FIA流路中设计了一个异步注入阀，利用此阀将清洗液在“酶试样塞”之后注入FIA系统（60 μL），以达到对FIA系统自动清洗，减小基线漂移的效果。

为了考察此效果，在FIA系统中分别用HCl和NaOH作为清洗液，萝卜提取液作为测试样品，得到了图2中的两条实测曲线。随着清洗液浓度（HCl和NaOH）增加，基线漂移值减小；在相同浓度下，HCl的清洗效果（基线漂移值）优于NaOH。所以，最后选取0.4 mol/L HCl溶液作为清洗剂。

3.2 反应体系影响因素的考察

3.2.1 POD最适温度 温度是影响POD活性的因素之一。低温使酶活性不能完全显现，高温又会使酶蛋白变性，丧失活性。将FIA-SP-POD系统的RC置于恒温控制器内，先用热电偶对RC出口液的温度进行校正，然后用白萝卜提取液作为测试样品，在不同温度下（25℃～70℃）考察了温度与白萝卜POD活性的相关性。结果见图3a。在60℃时， 酶催化反应产物的ΔA最大（此时FIA系统的平均留存时间Δt都相同，所以ΔA与反应速率ΔA/Δt及Ec成正比关系），当温度大于60℃时， ΔA开始降低，即高温导致POD失活，POD的催化活力下降。由此可知白萝卜POD最适温度为60℃，此结果与文献＼[28＼]一致。

3.2.2 POD最适pH值 酸度对酶活性的影响，不是酸、碱对酶分子解离状态的影响，而是对酶活性中心或相关基团解离状态的影响。因此本实验用白萝卜提取液作为测试样品，考察了磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L）的酸度（pH 3.0～9.0）对反应体系中POD活性的影响。除温度控制在60℃外，其它条件同上。由图3b所示的结果可知，当pH 在3～5.5范围时，pH 增加，ΔA增大，即POD催化生成的产物增多；在pH 5.5～9.0范围时，pH 增加，ΔA反而降低，即POD催化生成的产物减少；在pH 5.5时产物最多即POD活性最强。由此可知萝卜中所含的POD的最适pH 为5.5。

3.2.3 H2O2浓度的考察 在上述优选条件下，考察反应体系中H2O2浓度（0～2.0 mmol/L）对POD催化反应的影响。得到的结果见图3c。可以看出：在给定的Δt值下，H2O2浓度增加，产物ΔA逐渐增大，当此浓度大于1.5 mmol/L时，产物ΔA不再变化，即POD催化产物的生成速率趋于稳定。因此， 将H2O2浓度设定为1.5 mmol/L。在此基础上，以H2O2为底物作Lineweaver-Burk双倒数图，根据双倒数图的截距，计算得到以H2O2为底物的米氏常数（Km）为0.21 mmol/L，酶促反应最大速度（Vmax）为1.155 mmol/（L·min）。

3.2.4 GA浓度的考察 在上述优选条件下，也考察了GA浓度（0～4.0 mmol/L）对POD酶催化反应的影响。得到的结果见图3d。在给定的Δt值下，曲线的变化趋势与H2O2底物相似，即随着GA/POD/H2O2反应体系中GA浓度增大，ΔA先迅速增大后不再变化；当浓度大于3.5 mmol/L时，反应速率（ΔA/Δt）趋于稳定。故本系统选定GA浓度为3.5 mmol/L。同样以GA为底物作Lineweaver-Burk双倒数图，再根据此图计算出以GA为底物的Km′和Vmax′值分别为0.20 mmol/L和0.539 mmol L1·min1。结果表明：白萝卜POD与GA之间的亲和力与H2O2相差不大。

3.3 干扰离子对POD活性测定影响

金属离子可能与POD形成络合物进而影响POD活性，本实验考察了4种盐溶液（FeCl3， CuSO4， ZnSO4， CoSO4）对POD活性测定的影响。实验时，白萝卜POD作为测试样品，在0～0.8 mmol/L范围内改变FIA-SP-POD系统载流中的金属离子浓度，得到的结果见图4。从图4a可知，随着Fe3+， Cu2+， Zn2+， Co2+浓度的增加，在给定的Δt值下，相关的ΔA都有增大的趋势，即Fe3+， Cu2+， Zn2+， Co2+对POD均有一定程度的激活作用；POD激活顺序为Fe3+ > Cu2+ > Zn2+ > Co2+。所以，在提取白萝卜POD时，要避免接触这些金属离子，防止发生酶促褐变。

此外，在载流中分别添加柠檬酸（0～20 mmol/L）、抗坏血酸（0～0.2 mmol/L）和L-半胱氨酸（0～2.0 mmol/L），考察了这些有机酸类对POD活性的影响。从得到的图4b～d 3条曲线可以看出：添加的有机酸浓度增大，在给定的Δt值下吸光度都逐渐降低。这表明这3种有机酸对POD活性有明显的抑制作用，其抑制作用顺序为抗坏血酸>L-半胱氨酸>柠檬酸。由于L-半胱氨酸和柠檬酸都与POD活性中心的Fe3+发生螯合反应，使酶活性中心失去催化功能，因而抑制了POD的活性或减弱了POD与底物的亲和力。

3.4 摩尔吸收系数测定

常规比色法测定POD活性时，是利用H2O2/POD/GA体系反应产物在470 nm处的ΔA值，带入公式（2）计算得到。但本研究发现：ε值是准确定量POD酶活性的最关键因素；当所用仪器（波长分辨率、灵敏度）及方法的测试条件（温度、pH 及溶剂）不同时得到的ε不同。所以，计算POD活性时不能直接将文献或商家给出的ε值代入公式（2）进行计算，须在选定条件下用所选仪器进行测定。

因此，本实验对准确测定ε2-GA方法进行了研究。由于2-GA不稳定、无法提纯，不能通过直接测定其吸光度值得到ε2-GA值，只能利用GA浓度间接求出2-GA的浓度（2H2O+2GA（POD）2-GA+4H2O）。理论上，当H2O2/POD/GA体系中POD过量， 且H2O2浓度远大于GA时，可认为GA完全转化为2-GA。所以， 对所需的POD活性浓度、H2O2/GA浓度比进行了考察。

3.4.1 GA完全转化为产物所需的HRP活性浓度 用商品化的HRP作为测试样品，分别取20 μL的50， 100， 250， 500， 1000和2500 U/L HRP，加入0.5 mmol/L H2O2+1.5 mmol/L GA混合液中[26]测定2-GA的吸光度，结果见图5a。当HRP浓度小于1.0 kU/L时，2-GA的吸光度随HRP活性浓度增加而增大，当HRP浓度大于1.0 kU/L时，2-GA的吸光度不再变化，即此时HRP活性浓度能使GA完全转化为产物。

3.4.2 GA完全转化为产物所需的H2O2的浓度 选定HRP为1.0 kU/L、GA浓度为0.2 mmol/L，使其与不同浓度的H2O2（0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0和2.0 mmol/L）按1+1混合，测定其产物2-GA的吸光度，结果见图5b，产物吸光度随H2O2浓度增加呈线性增加趋势，当H2O2浓度大于GA浓度的5倍时，产物吸光度不再随H2O2浓度而变化。由此得出结论：当HRP为1.0 kU/L、H2O2/GA浓度比大于5时，GA能完全转化为产物2-GA。因此，此时可根据已知的GA浓度换算出反应系统中的2-GA浓度，再将其带入朗伯-比尔定律，就求得ε2-GA。在室温（～20℃）下，用手工比色和5点平均数据得到的ε2-GA值为0.0122±0.0031 L/（μmol·cm）。

3.4.3 产物摩尔吸收系数的平均值 为了得到FIA法测定白萝卜POD的ε2-GA，用稀释一倍后的白萝卜粗酶液作为样品（Ec>1.0 kU/L），FIA系统中载流为PBS缓冲液（pH 5.5），R1（H2O2/GA）按1+1混合、且浓度比大于5 （H2O2/GA： 1.5/0.01， 1.5/0.04， 1.5/0.08， 1.5/0.12， 1.5/0.16， 1.5/0.20和1.5/0.24 mmol/L），在60℃下测定了FIA-SP-POD系统中H2O2/POD/GA反应体系形成的产物吸光度，并将换算出的2-GA浓度（1.25， 5， 10， 15， 20， 25和30 μmol/L，c2-GA= 1000×（cGA/4）/2）与其吸光度值进行数学回归，最后得到相关的线性方程：ΔA=0.0125c2-GA+0.050 （r=0.9995）；此斜率值0.0125 L （μmol cm）1即为本系统的ε2-GA平均值。

3.5 萝卜POD活性测定

考察了POD的线性响应范围和精密度以及检出限。在优选条件下，一系列HRP标液作为样品，用FIA-SP-POD系统检出它们在Δt下的ΔA值，然后代入公式3，求出对应的POD活性值。结果表明：在给定的Δt（0.53 min）下，在450～7260 U/L范围内HRP活性浓度与ΔA值呈现良好的线性相关（ΔA=0.00013Ec+ 0.0012，r=0.9985）。随后，分别用500 U/L、2500 U/L HRP标液进行11次测定，得到两组标液的RSD分别为0.62%（c=501±3 U/L）、0.31%（c=2530±8 U/L）；此结果表明本方法测定POD活性浓度的精度很好；用 500 U/L HRP为样品，计算得到本方法的检出限为7.0 U/L （cL=3SD/K， SD=0.000326， K=0.00013）。

用pH 5.5磷酸盐缓冲液将萝卜提取液按10%， 15%， 20%， 25%， 30%和35%比例稀释成6个样品（Ec10～Ec35），分别注入FIA-SP-POD系统，在给定的Δt下，检测其催化产物的ΔA（0.067， 0.105， 0.135， 0.170， 0.193， 0.220），得到了一条萝卜提取液与ΔA呈良好线性关系的相关曲线（ΔA=0.638c+0.004， r=0.9965）， 表明本方法基于平均留存时间（Δt）处的ΔA能快速准确地定量POD活性浓度。

另外，模拟手工酶动力学曲线法在本系统上采用流动注射停留法，对上述稀释的萝卜POD活性进行了测定。操作过程是：注入酶样品32s后停泵（在响应峰的最大值之后停泵），连续记录H2O2/POD/GA体系在后30s期间内的催化反应动力学曲线（ΔA vs Δt），根据此区间曲线的斜率，求得POD活性浓度。得到的数据表明，停留法的结果（Ec10：777±3 U/L，Ec15：1211±13 U/L，Ec20：1470±14 U/L，Ec25：1760±30 U/L， Ec30：2075±20 U/L，Ec35：2268±23 U/L）与上述FIA-SP-POD系统的结果（Ec10：706±8 U/L，Ec15：1105±6 U/L，Ec20：1425±22 U/L，Ec25：1802±6 U/L，Ec30：2034±27 U/L，Ec35：2323±32 U/L）是一致的。

选取4种萝卜的提取液作为酶样品，用FIA-SP-POD系统测定其产物的吸光度，然后代入公式3，得到POD活性值。得到结果为：红皮萝卜（14673 U/L）>青萝卜（14365 U/L）>圆萝卜（13076 U/L）>白萝卜（8309 U/L）。为了考察本方法的可靠性，用HRP标准进行了加标回收率实验（表1）。考虑到HRP自然失活的影响，每次加标实验前先对HRP活性进行了校正。本方法的回收率在95.2%～107.1%之间，结果满意。

4 结 论

本研究基于H2O2/POD/GA反应体系，利用流动注射吸光度/留存时间比值法，建立了一种无需标准曲线的POD活性快速准确测定新方法，分析速度可达40样/h。用本方法测定POD活性，不但减少了手工操作带来的误差，而且具有准确度高、重现性好、分析速度快、自动化程度高的优点。

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