超高效液相色谱-串联质谱分析人乳中的3种雌激素

曹宇彤，任皓威，刘宁

（1.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150028；2.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

超高效液相色谱-串联质谱分析人乳中的3种雌激素

曹宇彤1,2，任皓威1,2，刘宁1,2

（1.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150028；2.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的方法对我国人乳中雌激素含量进行分析测定。样品经酶解，提取，固相萃取柱净化和浓缩后，采用Waters UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)分离，以MRM多反应监测扫描模式检测，外标法定量分析。在0.5～20 ng/mL范围内，校准曲线呈现良好的线性，相关系数(R2)大于0.99。结果表明，该方法具有良好灵敏度、准确度。该方法已成功应用于人乳中3种雌激素的定性和定量分析。

人乳；雌激素；超高效液相色谱-串联质谱；固相萃取

0 引言

人乳是婴儿的安全、天然营养食品，在提供营养、促进生长发育、健全神经系统、增强免疫力等方面起重要作用[1-5]。人乳中含有雌激素，主要包括雌二醇（estradiol，E2）、雌三醇（estriol，E3）和雌酮（Estrone，E1）等。这些激素对婴儿的代谢平衡、生长发育、性别的开发和促进等起重要的调节作用[6-9]。由于它们在低浓度下对生物也有很强的生物活性[10]，低浓度的激素摄入是否会对婴儿健康造成影响已备受人们关注。中国约有一半以上的婴儿家庭采取婴儿配方奶粉喂养的方式对婴儿喂养。因此，使婴儿配方奶粉更加接近母乳成分尤为重要。本研究建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定中国人乳中雌激素的方法，通过对人乳中雌激素分析，为雌激素在婴儿配方奶粉中的安全残留量的检测提供可靠的依据。

1 实验

1.1材料与仪器

人乳样品采自年龄在23～35岁（平均孕期为40周）的中国汉族乳母。乳母身体指标正常，无妊娠高血压、糖尿病及其他影响脂质代谢的疾病。初乳（1～ 5 d）样品10个，过渡乳（6～21 d）样品13个，成熟乳（21 d以后）样品16个，每个阶段分别采集50 mL供实验用。标准品为雌酮、雌二醇、雌三醇，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。甲醇、乙腈均为色谱纯，正己烷、乙酸乙酯和丙酮均为分析纯。超高效液相色谱仪，QTRAP®6500质谱仪。MTN-2800D氮吹仪，纯水发生器，AL204精密电子天平，ZHWY-100B台式振荡器，PK-98-1型电子恒温水浴锅，超速离心机。

1.2方法

1.2.1 人乳的采集

对哈尔滨地区不同泌乳阶段的健康女性随机采集，使用自动采乳器采集不同泌乳期的中国人乳各50 mL左右，将获得的人乳收集到无菌奶瓶中，盖上瓶盖，摇匀。把乳样分装到5个10 mL的无菌离心管中，粘贴上统一的标签（包括乳母姓名、采集时间和样品量），放到离心管泡沫架上，置于-20℃冰箱中，待采集完毕后，将乳样统一存放至-80℃冰箱中，待分析。

1.2.2 标准曲线的绘制

取3种雌激素的标准品用甲醇配制成质量浓度为1 mg/mL的储备溶液，于-20℃贮存，用时稀释。将标准储备溶液中的每一种都用甲醇分别稀释成质量浓度为0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL的混合标准系列溶液。在实验色谱条件下，分别取2 μL进样，测定保留时间和峰面积，以测得的标准品峰面积对质量浓度（μg/L）绘制标准曲线。

1.2.3 人乳中雌激素的提取

向样品中加入40 μL的β-葡萄糖醛酸甙酶涡旋混合于37℃振荡酶解12 h。取出后冷却至室温，加入10 mL乙腈，涡旋2 min，室温下超声提取15 min，于4℃，转速为10 000 r/min下离心10 min，有机相转入玻璃管中，残渣用10 mL乙腈重复提取1次，合并有机相于玻璃管中。有机相于40℃氮气吹至近干，加5 mL体积分数为30%甲醇水溶液溶解，将此溶液过HLB柱（柱子先用5 mL甲醇和5 mL水依次活化），用5 mL体积分数为30%甲醇水溶液淋洗，真空抽干，然后用5 mL甲醇洗脱柱子，洗脱液在40℃氮气吹至近干，用甲醇溶液溶解浓缩物并定容至1.0 mL，过0.22 μm有机滤膜，待检测。

1.2.4 色谱及质谱条件

色谱柱：Acquity UPLC XDB C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；负离子模式下流动相为乙腈溶液，梯度洗脱，0 min，20%乙腈；0～1 min，20%～50%乙腈；1～5 min，50%乙腈；流速为0.5 mL/min；柱温为35℃；进样量为2 μL。

质谱检测在多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）下完成。雌激素在负离子（ESI-）模式下检测。ESI-界面操作条件为：碰撞气压（colli⁃sion gas，CAD）0.04 MPa；气帘气压（curtain gas，CUR）0.24 MPa；雾化气压（ion source gas 1，GS 1）0.27 MPa；去溶剂气压（ion source gas 2，GS 2）0.48 MPa；离子喷雾电压（ion spray voltage，IS）-4500 V；离子源温度（ion source temperature，TEM）500℃。

1.2.5 统计学处理

分析结果采用AB质谱analyst工作站软件所采集提供的数据。采用Excel电子表格软件进行数据录入，计量资料数据采用平均值表示并用采用t检验对其进行比较。使用Sigma Plot 11.0软件进行作图。每个独立实验均做平行实验，以求得准确性好、稳定性高的实验数据。

2 结果与分析

2.1人乳雌激素前处理方法的优化

2.1.1 雌激素的酶解

人乳中游离态的雌酮（E1）仅占雌酮总量的4.35%，其主要的雌激素代谢产物表现形式为葡萄糖醛酸结合物（estrone glucosiduronaes，E1G），占雌酮总量的33%～55%，其余以硫酸酯形式存在；人乳中游离态的雌二醇（E2）占总量的20%左右，以葡糖酸苷酯和硫酸酯形式存在的雌二醇各占总量的40%；人乳中游离态的雌三醇（E3）仅占总量的3.1%左右，以葡糖酸苷酯和硫酸酯形式存在的分别占近50%和47%。总之，在人乳中结合态雌激素占总量90%以上，而人初乳中非结合态雌激素仅占总量的4.8%左右[11]。人乳内的结合态的雌激素可能直接来源于血液或者是乳腺细胞内甾醇前体的代谢产物。人乳中的雌激素主要以游离态和结合态两种形式存在，仅检测游离部分不能得到3种雌激素的总体含量，因此需要对雌激素进行酶解，而检测雌激素总量时则需要用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解样品后再进行测定。本研究在样本预处理中，先用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解释放雌激素，再进行固相萃取。

2.1.2 提取溶剂的优化

选择合适的提取试剂和提取方法，对雌激素回收效率至关重要。本研究采取有机溶剂提取，结合振荡和超声方式以促进分析物进入有机溶剂中。人乳样品中蛋白质和脂肪是主要成分，同时也是干扰物的主要来源，因此样品中蛋白质和脂肪的去除以及待测组分的提取是样品前处理过程的关键。雌激素在非极性溶剂中溶解度低，提取试剂的极性应与分析物的极性匹配。实验中3种雌激素较易溶解于极性溶剂中，因此，考察了正己烷、甲醇、乙腈及乙酸乙酯4种不同提取溶剂对回收率的影响。4种提取溶剂的影响结果如图1所示。结果表明，甲醇和乙腈由于极性较强对样品的穿透力强于乙酸乙酯和正己烷；但是，样品中脂肪等基质干扰物易溶于甲醇，增加了后续SPE柱净化难度；并且乙酸乙酯萃取后溶液呈深土黄色，杂质干扰较大，不易净化，平均回收率仅为49.72%；正己烷和甲醇的提取效果较差，3种激素的平均回收率在57.16%和61.15%左右；而乙腈作为提取溶剂得到的平均回收率为82.53%，乙腈提取效率最高，并具有沉淀蛋白作用，乙腈提取溶液最干净。故选取乙腈作为提取溶液，能够获得3种雌激素较好的提取效果。

图1 提取溶剂对回收率的影响

2.1.3 固相萃取柱的优化

由于人乳中的雌激素含量很低，并且甘油三酯等干扰杂质较多，含量较大，因此本研究采用固相萃取柱进行样品的净化。雌激素含有甾族结构，极性大多为中等或者偏弱，用亲水亲脂平衡（Hydrophobic-li⁃pophilic balance，HLB）柱[12]、C18柱[13]和MCX柱[14]净化。不同固相萃取柱对类固醇的净化效果的影响见图2。结果表明，C18对雌三醇、雌二醇回收率只有HLB柱的一半。HLB柱对于雌二醇、雌三醇的回收率很高，能够达到82.60%和83.18%。而MCX柱对于雌激素的回收率处于C18柱和HLB柱两者回收率之间。HLB柱、C18柱和MCX柱对雌激素的平均回收率分别为81.38%、57.57%和71.74%。并且三个柱子中HLB柱最能保持优良的润湿性，可以避免由于意外干涸所导致的稳定性差和回收率低的问题，因此本研究中应用HLB柱进行雌激素的萃取和净化。

图2 固相萃取柱对回收率的影响

2.1.4 固相萃取洗脱溶液的优化

常用的固相萃取洗脱溶液有丙酮、甲醇、乙腈等。本研究考查了丙酮、甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1/1，体积比）混合液对雌激素的洗脱能力。四种洗脱液的洗脱效果见表3。结果显示，丙酮洗脱时，平均回收率为66.15%，甲醇洗脱时，其平均回收率为65.34%，乙腈洗脱时，其平均回收率为72.07%，甲醇-乙腈（1/1，体积比）洗脱时，平均回收率为85.53%。由此可看出，甲醇-乙腈（1/1，体积比）混合液的洗脱能力最强，故选取甲醇-乙腈（1/1，体积比）作为洗脱溶剂。

图3 固相萃取洗脱溶剂对回收率的影响

2.1.5 超高效液相色谱-串联质谱条件优化

本实验首先选择甲醇-水和乙腈-水作为流动相来同时分析3种雌激素的分离效果，发现甲醇-水不能将电离模式为负的3种雌激素全部出峰，而乙腈-水可以使电离模式为负的雌激素出峰分离。为了有利于雌激素化合物的离子化，在负离子模式下流动相水相中加入体积分数0.1%氨水，各激素的峰形和灵敏度没有多大改善。因此采用乙腈-水作为流动相分析3种雌激素。对标准溶液和样品分别进行全扫描，再调节碰撞能量，分别选取经碰撞后所得丰度较高、碎片结构合理的两个子离子作为定量和定性离子，并优化其最佳去簇电压和碰撞能量。最终确定的质谱参数如表1所示。

表1 3种雌激素的质谱参数

2.2超高效液相色谱-串联质谱方法学验证

2.2.1 线性关系

用甲醇配制3种雌激素的标准溶液，配制范围为0.5～20 ng/mL，以激素定量离子色谱峰面积（Y）为纵坐标，相应浓度（X）为横坐标绘制校准曲线。3种雌激素具有良好的线性关系，相关系数R2均大于0.99，结果如表2所示。

表2 3种雌激素的线性方程、相关系数、LOD和LOQ

仪器基线3倍信噪比（S/N）对应的样品中雌激素浓度作为方法检出限（LOD），因此3种雌激素检出限在0.19～0.25 ng/mL范围内；仪器基线10倍信噪比（S/ N）对应的样品中雌激素浓度为方法定量限（LOQ），因此定量限在0.69～0.85 ng/mL范围内。

2.2.2 回收率和精密度

按照1.0，5.0，10.0 ng/mL质量浓度水平对人乳样品进行添加回收实验。分别在3段泌乳期的样品中添加3种不同水平的混合标准溶液，按实验方法进行预处理，每个水平重复测定5次，分别计算平均回收率和相对标准偏差，方法结果满意，具体数值参如表3所示。

表3 3种雌激素加标的回收率和精密度（n=5） %

2.3人乳雌激素超高效液相色谱-质谱法分析

应用本研究建立的方法对三个阶段泌乳期的10个初乳样品、13个过渡乳样品和16个成熟乳样品进行分析，在上述色谱条件下，保留时间分别为：雌酮3.34 min，雌二醇2.88 min和雌三醇1.27 min，如图4所示。超高效液相色谱-串联质谱检测应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子，表明方法专一性良好。具体各雌激素在三段泌乳期中的含量及变化情况参见表4。由表4可知，初乳中雌激素含量很高，雌酮平均质量浓度3.78 ng/mL，雌二醇平均质量浓度最高，达到7.4 ng/mL，雌三醇平均质量浓度达到4.05 ng/mL。三种雌激素质量浓度都随着泌乳期的延长而降低。

图4 3种雌激素色谱

图4中，cps全称为count per second，其物理意义是每秒检测到的离子个数”。

表4 各泌乳期中国人乳3种雌激素质量浓度 ng/mL

3 结论

建立了提取和检测人乳中3种雌激素的超高效液相色谱/串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。优化了样品前处理技术和色谱质谱条件。该法线性关系良好（R2=0.99）、准确度和精密度良好，RSD在2.07%～ 3.92%之间，方法的检出限LOD在0.19～0.25 ng/mL之间，同其他方法相比一致或更低。所建方法已成功应用于实际人乳样品的检测。由于人乳被认为是婴儿完美的食物，其雌激素的质量浓度可以作为食品和营养专家为婴儿的膳食调配的一个参考，同时采集的数据也可以作为婴儿配方奶粉中雌激素安全的残留质量浓度的一个标准。

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Analysis of three estrogens in Chinese human milk using UPLC/MS/MS

CAO Yu-tong1,2，REN Hao-wei1,2，LIU Ning1,2
（1.National Dairy Engineering&Technical Research Center，Harbin 150028，China;2.Northeast Agricultural Univer⁃sity，College of Food Science，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Harbin 150030，China）

An effective method was established with an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC/MS/ MS）method for determination of steroid hormones in Chinese human milk.Samples were treated with enzymatic hydrolysis，extraction，pu⁃rification with solid phase extraction（SPE）column and concentration，separation by a Waters UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）chromatographic column，and reaction monitoring for MS/MS scan pattern detection，and the quantification was performed with standard method.Calibration curve showed a good linear correlation coefficient（R2）that was above 0.99.The results showed that this method has good sensitivity and accuracy.The method has been successfully applied to qualitative and quantitative analysis for 3 estrogens in human milk.

human milk；estrogen；UPLC/MS/MS；SPE

TS252.1

A

1001-2230（2016）09-0052-04

2016-03-28

“十二五”国家科技支撑计划（2011BAD09B03）

曹宇彤（1990-），女，硕士研究生，研究方向为营养与乳制品加工技术。

刘宁