陕西省生鲜乳中β-内酰胺酶的检测与结果分析

(陕西省产品质量监督检验研究院，西安710048）

陕西省生鲜乳中β-内酰胺酶的检测与结果分析

秦婧，张莉，舒静，樊成

(陕西省产品质量监督检验研究院，西安710048）

本次检测共有149份生鲜乳样品，其中鲜牛乳96份，鲜羊乳53份。旨在了解陕西省生鲜乳中是否含有β-内酰胺酶及其残留状况。采用食品整治办[2009]29号指定检验方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法-杯碟法》。结果 共检出17份β-内酰胺酶阳性样品，阳性样品检出率为11.4%。17份阳性样品中，鲜牛乳9份，鲜牛乳阳性样品检出率为9.4%；鲜羊乳8份，鲜羊乳阳性样品检出率为15.1%。17个阳性样品的dA与dB差值较大在6.08-13.3mm。本次检测样品阳性检出率较高为11.4%，且阳性样品中所残留的β-内酰胺酶含量较高，可见生鲜乳中抗生素和β-内酰胺酶监管形势依然严峻。

β-内酰胺酶；杯碟法；生鲜乳；抗生素

0 引言

乳类及乳制品在我国国民膳食中占有重要地位，但是近年来乳类及乳制品中抗生素残留问题十分严重。主要是奶农为治疗奶畜的乳腺炎，向奶畜注射或在饲料中加入抗生素。一些奶农在利益驱使下，为掩盖乳品中残留的抗生素向乳品中添加β-内酰胺酶。β-内酰胺酶是一种解抗剂，将其加入到添加了抗生素的乳类及乳制品中，可将其中的抗生素分解，从而干扰检测，使得在定性检测抗生素时无法正常显示阳性检出结果。卫生部于2009年2月将β-内酰胺酶列入禁止在乳品（包括生鲜乳）中添加的非食用物质名单[1]。本次检测旨在了解陕西省生鲜乳中是否含有β-内酰胺酶及其残留状况，现将检测结果进行报告和分析。检验方法采用食品整治办[2009]29号指定检验方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法-杯碟法》[2]。

1 实验

1.1样品与菌种

本次检测样品共149份，其中鲜牛乳96份，鲜羊乳53份。由于生鲜乳不易保存，为保证检测准确性，样品采集后须立即放入0～4℃冷藏箱中保存，并于采样当天送至实验室进行检测。

试 验 菌 种 ：藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus) CMCC(B)28001，传代次数不得超过14次。

1.2材料与设备

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：抑菌圈测量仪；恒温培养箱（36℃±1℃）；高压灭菌器；无菌培养皿:内径90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖；无菌牛津杯（外径8.0 mm±0.1 mm，内径6.0 mm±0.1 mm，高度10.0 mm±0.1mm）；麦氏比浊仪；无菌吸管1 mL（0.01 mL刻度值），10 mL（0.1 mL刻度值）；加样器为5～20 μL，20～200 μL及配套吸头。

1.3培养基和试剂

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/ T6682中规定的三级水。

磷酸盐缓冲溶液pH值为6.0，生理盐水（8.5 g/L），青霉素标准品（纯度99.0%），舒巴坦标准品，β-内酰胺酶标准溶液，活性170 000 U/mL，营养琼脂培养基，抗生素检测用培养基Ⅱ。

2 方法

检测方法采用食品整治办[2009]29号指定检验方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法-杯碟法》。

2.1菌悬液的制备

1988年，昆明供电局所辖35千伏至220千伏变电站为24座，总容量仅166万千伏安，年供电量仅有37.8亿千瓦时。而到了2018年1月12日，昆明供电局单日全社会用电量突破1.1亿千瓦时。

将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经（36±1）℃培养18～24 h，用生理盐水洗下菌苔即为菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×1010mL-1，4℃保存，贮存期限2周。

2.2样品的制备

将待检样品充分混匀，取1 mL待检样品于1.5 mL离心管中共4管，分别标为A，B，C，D；每个样品做三个平行，共12管，同时每次检验应取纯水1 mL加入到1.5 mL离心管中作为对照。

2.3检验用平板的制备

取90 mm灭菌玻璃培养皿，底层加10 mL灭菌的抗生素检测用培养基Ⅱ,凝固后上层加入5 mL含有浓度为1×108mL-1藤黄微球菌的抗生素检测用培养基Ⅱ,凝固后备用。

2.4样品的测定

按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到样品及纯水中：A青霉素5 μL；B舒巴坦25 μL和青霉素5 μL；Cβ-内酰胺酶25 μL和青霉素G 5 μL；Dβ-内酰胺酶25 μL，舒巴坦25 μL，青霉素5 μL。

混匀后，将上述A～D试样各200 μL加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36±1℃培养培养18～22 h，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。

2.5结果报告

纯水样品结果应为：A、B、D均应产生抑菌圈；A的抑菌圈与B的抑菌圈相比，差异在3 mm以内(含3 mm)，且重复性良好；C的抑菌圈小于D的抑菌圈，差异在3 mm以上(含3 mm)，且重复性良好。如为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定：

（1）如果样品结果中B和D均产生抑菌圈，且C与D抑菌圈差异在3 mm以上（含3 mm）时，可按下面I和II判定结果。

I．A的抑菌圈小于B的抑菌圈差异在3 mm以上(含3 mm),且重复性良好，应判定该试样添加有β-内酰胺酶，报告β-内酰胺酶类药物检验结果阳性。

II．A的抑菌圈同B的抑菌圈差异小于3 mm，且重复性良好，应判定该试样未添加有β-内酰胺酶，报告β-内酰胺酶类药物检验结果阴性。

（2）如果A和B均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再进行检测。

3 结果与分析

3.1 β-内酰胺酶阳性样品检出情况

本次检测共149份生鲜乳样品，其中鲜牛乳96份，鲜羊乳53份，检测结果如表1所示。

表1 生鲜乳中β-内酰胺酶检测结果

（1）共检出17份β-内酰胺酶阳性样品，阳性样品检出率为11.4%。17份阳性样品中，鲜牛乳9份，鲜牛乳阳性样品检出率为9.4%；鲜羊乳8份，鲜羊乳阳性样品检出率为15.1%。

（2）本次针对生鲜乳中β-内酰胺酶的检测，阳性检出率较高为11.4%，结果并不理想，可见仍有部分奶农因利益驱使向含有抗生素的生乳中添加了β-内酰胺酶以降解其中的抗生素。

3.2 β-内酰胺酶阳性样品数据分析

本次监测共检出17份阳性样品，数据如表2所示。表2中dA、dB、dC、dD分别为A、B、C、D抑菌圈直径。

（1）由表2知，无论鲜牛乳或鲜羊乳，均有样品的dA=8.00 mm和dA＞8.00 mm。dA=8.00mm，即A并未产生抑菌圈（牛津杯的直径为8.00mm），说明A中的青霉素完全被样品中的β-内酰胺酶分解，样品中β-内酰胺酶含量较高。dA＞8.00 mm的样品，dA小于dB且dA与dB的差值在3 mm以上，说明样品中含有一定量的β-内酰胺酶，分解A中一定量的青霉素；在B中由于有舒巴坦的存在，抑制了β-内酰胺酶活性，使得青霉素未被完全分解且青霉素剩余含量较高，B的抑菌圈也较大，dB大于dA且差值在3 mm以上。因此，dA= 8.00 mm的样品比dA＞8.00 mm的样品所残留的β-内酰胺酶含量高。

（2）由表2知，每个样品dC=8.00 mm，即C未产生抑菌圈。C中本身存在β-内酰胺酶和青霉素，无论样品中是否存在β-内酰胺酶，青霉素都会被本身存在的β-内酰胺酶完全分解，C不产生抑菌圈，故dC=8.00 mm。

（3）17个阳性样品的dA与dB差值较大，最低为鲜牛乳5的6.08 mm，最高为鲜牛乳2的13.30 mm，有3个样品在7～9 mm之间，其他12个样品均在9 mm以上。综合（1）和（2）可知，检出的17个阳性样品中所残留的β-内酰胺酶含量较高。

3.3讨论

综合3.1和3.2可知，本次检测共检出17份β-内酰胺酶阳性样品，阳性样品检出率高达11.4%，且阳性样品中所残留的β-内酰胺酶含量较高。

近年来，虽然国家陆续出台相关法律文件且政府相关部门加大对使用非法添加物行为的打击力度，企业也提高对β-内酰胺酶的检验频率，但生鲜乳中β-内酰胺酶的非法添加仍然屡禁不止，本次监测样品阳性检出率高达11.4%。其中，鲜羊乳的阳性检出率为15.1%高于鲜牛乳的9.4%。陕西作为奶牛和奶羊养殖大省，养殖模式单一仍以农户散养为主，由于乳腺炎等疾病频发和抗生素滥用问题突出，造成生鲜乳中抗生素残留十分严重。所以，一些奶农向生鲜乳中添加β-内酰胺酶以掩盖其中的抗生素。这种现状亟需改变，因此建议：

表2 阳性样品实验数据mm

（续表2）

（1）尽快出台乳及乳制品中β-内酰胺酶检测国家标准和打击使用非法添加物行为的法律法规；

（2）监测部门完善抽检方案，提高对生鲜乳的抽检频率和效率，使生鲜乳抽检常态化、随机化，尤其是在奶牛和奶羊疾病高发期；

（3）农业部系统应加强奶畜休药期的管理，严厉打击抗生素滥用行为。

（4）加强对奶牛和奶羊的综合管理，鼓励并扶持企业自建养殖场，逐步形成大而强的牛羊乳业态产业链；

（5）逐渐探索并建立源头控制机制和溯源机制，从源头上解决抗生素滥用问题，使每一头牛羊，每一件乳产品都有完整的档案可查。

以上建议核心是健全食品安全监管机制，需要国家的组织和各相关部门相互配合相互协调，还需要社会各界的大力支持，乳品安全仍然任重而道远。

[1]卫生部.关于印发《全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治近期工作重点及要求》的通知（卫监督发[2009]21号）.

[2]食品整治办[2009]29号指定检验方法4乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法（杯碟法）.

Monitoring and analysis ofβ-Lactamase in raw milk in Shanxi province

QIN Jing，ZHANG Li，SHU Jing，FAN Cheng
(Product Quality Supervision and Inspection Institute of Shanxi Province,Xi’an 710048,China)

There are 149 samples of raw milk,including 96 cow’s milk and 53 samples of goat milk.The objective is to supervisingβ-lac⁃tamase residues in raw milk.The method of testingβ-lactamase in raw milk is based on“cylinder plate method”published by Ministry of China Health.The result shows thatβ-lactamase is detected in 17 samples(relevance ratio:11.4%).Among 17 samples,there are 9 samples of cow’s milk(relevance ratio:9.4%)and 8 samples of goat milk(relevance ratio:15.1%).The differences between bacteriostatic ring of 17 positive samples were among 6.08～13.3mm.The relevance ratio is 11.4%and the remainingβ-lactamase content in positive samples is high⁃er.So antibiotic andβ-lactemase still exist in raw milk，relevant government departments should strengthen the supervision.

β-lactemase;cylinder plate method;raw mik;antibiotic

TS252.7

B

1001-2230（2016）09-0061-04

2016-01-21

秦婧（1989-），女，硕士研究生，从事食品检测工作。