蛋白质组学在人乳蛋白质研究中的应用

于文皓,祁艳霞,靳 艳

(1. 大连海洋大学食品科学与工程学院, 辽宁 大连 116023;2. 中国科学院大连化学物理研究所, 中国科学院分离分析化学重点实验室, 辽宁 大连 116023)

人乳是新生儿最理想的天然食物,富含新生儿生长发育所需要的各种重要营养成分[1]。蛋白质是人乳最重要的营养成分之一,人乳中蛋白质含量丰富且种类繁多。人乳蛋白质不仅为婴儿提供营养,人乳中的乳铁蛋白、溶菌酶等活性蛋白质还对婴儿免疫系统的形成、肠道菌群的构建起关键作用[2]。人乳蛋白质可分为酪蛋白(casein)、乳清蛋白(whey)和黏蛋白(mucin)3部分,其中黏蛋白也称为乳脂球膜蛋白(milk fat globule membrane, MFGM)[3]。人乳蛋白质的含量和组成差异不仅存在于个体之间,而且在哺乳期内呈动态变化。人乳中总蛋白质含量随着哺乳期的延长呈下降趋势,初乳(产后两天)中蛋白质质量浓度为14～16 g/L,成熟乳(产后14天后)中蛋白质含量逐渐降低为8～10 g/L。人乳中酪蛋白和乳清蛋白的比例在哺乳期内也是变化的,在泌乳期0～100天的过程中人乳中的蛋白质组分由80%乳清蛋白20%酪蛋白变为乳清蛋白和酪蛋白各占约50%[1]。

长期以来,由于分析检测方法的限制,对人乳蛋白质的研究大多停留在高丰度蛋白质的层面,对于低丰度蛋白质、翻译后修饰蛋白的研究非常有限[3]。随着蛋白质组学技术的发展及其在人乳蛋白质研究中的应用,对人乳蛋白质的研究从宏量营养研究进入微量营养研究阶段[4]。蛋白质组学技术目前已经广泛应用于人乳蛋白质的组成和动态变化研究、人乳中翻译后修饰蛋白如磷酸化蛋白、糖基化蛋白、人乳与其他物种乳汁的差异比较等研究中。蛋白质组学技术不仅揭示了人乳蛋白质的组成及功能,还用于婴儿过敏、乳母乳腺癌的诊断等相关疾病的研究[5]。本文对蛋白质组学技术应用于人乳蛋白质研究中的最新成果进行综述。

1 利用蛋白质组学研究人乳蛋白质组成

1.1 人乳蛋白质组成及动态变化的研究

蛋白质含量是人乳最重要的营养指标之一,目前常采用凯氏定氮法测定人乳总蛋白质含量,并以此作为衡量人乳蛋白质的主要指标。人乳中蛋白质种类较多,乳清蛋白包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳铁蛋白、骨桥蛋白等,酪蛋白包括α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白等。由于人乳蛋白质含量是动态变化的,因此单一蛋白质的含量更能真实反映人乳的营养状况。但是目前常用的蛋白质分析方法如高效液相色谱法、免疫法等均需要蛋白质标准品,而商品化的人乳单一蛋白质标准品非常有限,因此长久以来并没有较理想的人乳单一蛋白质的含量分析方法。

随着蛋白质组学技术的发展,蛋白质组学技术也被应用于定量分析人乳中单一蛋白质。陈启等[6]筛选了来源于人乳α-乳白蛋白的多肽CELSQLLK作为特征多肽,以同位素标记的特征多肽作内标物,建立了LC-MS/MS分析人乳α-乳白蛋白含量的方法。利用该方法分析了447份人乳样品,其中α-乳白蛋白的含量为300～450 mg/100 g人乳。该方法不受标准品的限制,具有较高的稳定性和特异性,可用于对不同阶段的人乳α-乳白蛋白的定量分析。Liao等[7]建立了基于强度的无标记定量方法(intensity-based absolute quantification, iBAQ)结合LC-MS/MS定量分析人乳中3种酪蛋白。该方法根据LC-MS/MS无标记定量的质谱数据计算3种酪蛋白所占比例,再根据总氨基酸的含量分别计算3种酪蛋白的浓度。利用该方法分析88份人乳样品的酪蛋白,3种酪蛋白的质量浓度分别为:α-酪蛋白,0.04～1.68 g/L;β-酪蛋白,0.04～4.42 g/L;κ-酪蛋白,0.10～1.72 g/L。该方法的特点在于:(1)改变了将酪蛋白与乳清蛋白分离后再分别测定蛋白质含量的传统分析方式,利用蛋白质组学的方法直接对样品进行分析,避免了因分离不彻底而导致测定含量不准确的问题;(2)用肽基N-糖苷酶(peptidylN-glycosidase F, PNGase F)脱除蛋白质上的糖基,避免蛋白翻译后修饰对准确性造成影响。利用该方法测定的乳清蛋白与酪蛋白的比例为45∶55～97∶3,乳清蛋白与酪蛋白的比例随着哺乳期延长而升高,这一结论与目前所认为的乳清蛋白与酪蛋白的比例随哺乳期延长而降低的结论截然相反,该方法是否准确反映了酪蛋白与乳清蛋白比例还需更多数据的验证。

人乳的组成在哺乳期内呈动态变化,定量蛋白质组学技术已应用于人乳蛋白质在哺乳期的动态变化研究中。Zhang等[8]利用串联质谱标记(tandem mass tag, TMT)的定量蛋白质组学技术,研究了人乳乳清蛋白在一年内的变化规律。在10位乳母的人乳样品中共鉴定到1 333个乳清蛋白,对其中615个乳清蛋白在一年的哺乳期内的变化规律进行定量跟踪研究。结果表明,人乳中糖蛋白的丰度在哺乳期内的变化与人乳中酶的表达水平相关;在哺乳后期,脂肪酸合成酶和硫酯酶的丰度上调,而载脂蛋白和血管生成素相关蛋白的丰度下调,说明人乳中的脂肪酸在哺乳初期主要来源于血液,随着哺乳期延长逐渐转变为来源于乳腺内合成。Zhang等[9]利用二甲基同位素标记的LC-MS/MS技术,定量研究了人乳蛋白质在哺乳期6个月内的变化规律。分别定性和定量了247和200个乳清蛋白,来源于不同个体、不同哺乳期的人乳样品中的乳清蛋白种类呈现高度相似性(重叠率为80%);定量研究的结果表明,个体和哺乳期引起人乳乳清蛋白含量的差别;同时发现,乳铁蛋白等活性蛋白质的含量变化与婴儿消化系统和免疫系统成熟程度密切相关。利用蛋白质组学技术研究人乳单一蛋白质含量变化及其与个体、哺乳期的相关性,不仅可以揭示人乳蛋白质变化的生理学意义,还可以深入了解婴儿的营养需求,对于婴儿配方奶粉的设计与研发具有指导意义。

1.2 人乳蛋白质与牛乳蛋白质的差异研究

牛乳是目前婴儿配方奶粉的主要基料来源,研究牛乳与人乳的蛋白质差异对于研发更适合婴儿生长所需的配方奶粉具有重要的意义。Zhang等[10]利用二甲基同位素标记法结合二维线性离子阱静电轨道阱组合式高分辨质谱(LTQ-Orbitrap),分别分析人乳和牛乳中的乳清蛋白,研究了人乳和牛乳乳清蛋白在泌乳期内的定量变化规律。人乳和牛乳中的酶、转运蛋白和免疫球蛋白等蛋白质在生物功能上呈现高度相似,但在含量上存在显著差异。人乳中胆汁盐激活脂肪酶较为丰富,而牛乳中胰核糖核酸酶更为突出;与牛乳相比较,随着泌乳期的延长人乳免疫相关蛋白质的减少速度更慢。Yang等[11]利用同位素标记定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)的LC-MS/MS技术,对人和牛的初乳和成熟乳的乳清蛋白进行了研究。在乳清蛋白中共定量了584种蛋白质,其中424种在人乳和牛乳中存在差异;通过GO功能注释(gene ontology)和KEGG代谢通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析两者的差异蛋白质,这些差异表达的蛋白质参与的KEGG途径主要涉及补体和凝血级联反应、对刺激的反应等生物调节;人乳和牛乳的差异乳清蛋白中有20种与酶调节活性相关、13种与免疫相关,结果表明牛乳与人乳在乳清蛋白部分存在较大差异。Yang等[12]用同样的方法对人乳和牛乳中的乳脂肪球膜蛋白进行了研究,在乳脂肪球膜蛋白中共定量到411种蛋白质,文中讨论了这些蛋白质的生理学意义。与二甲基同位素标记法相比,TMT标记和iTRAQ标记法对样品分级处理,经质谱可以鉴定到更多的蛋白质,因此在人乳中低丰度蛋白质的鉴定中应用更广泛。

2 利用修饰蛋白质组学研究人乳糖蛋白和磷酸化蛋白

2.1 人乳中糖蛋白的研究

人乳中含有丰富的糖蛋白,人乳中的糖蛋白具有广谱的抗病菌功能,可以保护婴儿免受细菌、真菌和病毒等病原体入侵[13-15],因此研究人乳糖蛋白对于婴儿健康具有非常重要的作用。人乳中乳清蛋白和乳脂球膜蛋白中大多蛋白质都是糖蛋白,酪蛋白中只有κ-酪蛋白是糖蛋白。寡糖是人乳最重要的组成之一,人初乳和成熟乳中的寡糖含量分别为22～24 g/L和12～13 g/L,高含量的人乳寡糖不仅掩盖了糖蛋白上糖的质谱信号,而且对确认糖基来源造成干扰。为了解决这个问题,Dallas等[16]利用冰乙醇先除去人乳寡糖,再用PNGase F酶对样品进行脱除糖链处理,用碳材料分别富集脱糖链样品和未脱糖链样品中的糖,利用Chip-TOF MS分析糖链。比较脱糖链样品与未脱糖链样品,脱糖链样品中比未脱糖链样品中丰度高两倍以上的糖认定为源于糖蛋白。利用该方法首次鉴定到糖蛋白上的糖链52个,其中25个是在人乳中首次发现;在鉴定的52个糖链中,65%为岩藻糖,38%为唾液酸,25%既有岩藻糖也有唾液酸。

乳脂肪球膜是在乳中负责包裹甘油三酯形成脂肪球的一类蛋白,约占人乳中蛋白质含量的2%～4%。乳脂肪球膜蛋白是糖基化程度很高的蛋白质,其中乳凝集素和嗜乳脂蛋白等已被证实具有抗菌、抗病毒的功能,因此乳脂肪球膜蛋白近年来受到越来越多的关注[2]。Yang等[17]利用凝集素富集糖蛋白、PNGase F脱除糖链的方法制备样品,利用LC-MS/MS技术研究了人、马、骆驼等8种哺乳动物的乳脂球膜蛋白的蛋白质N-糖基化情况。在所研究的样品中共鉴定到399个N-糖基化蛋白的677个糖基化位点,GO分析显示这些糖蛋白主要来源于细胞的膜组分,其中大部分与刺激、转运、免疫功能相关。Cao等[18]采用凝集素富集糖蛋白、LC-MS/MS分析、无标记(Label-free)的定量方法研究了人初乳和成熟乳中的乳脂肪球膜蛋白,在初乳和成熟乳的乳脂肪球膜中共鉴定到506个N-糖蛋白上的912个N-糖基化位点,其中有220个N-糖蛋白的304个N-糖基化位点在初乳和成熟乳中差异表达。GO分析显示这些N-糖蛋白主要来源于细胞器和细胞膜组分,与“蛋白结合”功能相关。通过人初乳和成熟乳中的N-糖蛋白及糖基化位点研究,定性和定量比较了人初乳和成熟乳在糖蛋白组成和生物学功能上的差异。同一研究小组[19]采用同样的方法分别对人初乳和成熟乳中乳清蛋白的N-糖基化蛋白进行定性和定量研究,在初乳乳清蛋白中鉴定到来源于63个蛋白质上的110个N-糖基化位点,在成熟乳的乳清蛋白中鉴定到来源于53个蛋白质上的91个N-糖基化位点,其中有38个蛋白质的68个糖基化位点在人的初乳和成熟乳乳清中差异表达。

Huang等[20]建立了无标记、多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)定量分析人乳糖蛋白的方法,该方法可定量分析糖基化位点和糖蛋白利用该方法定量分析了3位乳母的成熟乳中α-乳白蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白等5种糖蛋白。该方法可以实现快速获得指定位点的定量糖基化信息,具有较高的灵敏度和良好的重复性。

2.2 人乳中磷酸化蛋白的研究

人乳中含有大量的磷酸化蛋白质,其中高丰度的β-酪蛋白和αs1-酪蛋白都是高度磷酸化修饰的蛋白质。磷酸化蛋白可与钙、锌等离子结合,促进婴儿肠道对钙、锌等元素的吸收[2],因此对人乳中磷酸化蛋白质的研究对于婴儿健康具有重要意义。Molinari等[21]使用2-DE凝胶电泳技术对人乳蛋白质进行分离,利用质谱鉴定了目标蛋白质磷酸化,比较早产和足月产人乳中磷酸化蛋白的差异。研究发现,随哺乳期延长早产与足月产乳母的乳液中β-酪蛋白的磷酸化程度呈现差异。在所研究的8位足月乳母中,有7位乳母的乳样品中β-酪蛋白的磷酸化程度随哺乳期延长而降低;在所研究的16位早产乳母中,有10位乳母的乳样品中蛋白质磷酸化程度在哺乳期内未变化,而其他6位乳母的乳样品中蛋白质磷酸化程度随泌乳期延长而升高。Froehlich等[22]使用无标记定量的方法结合LC-MS/MS技术,对哺乳第一个月的人乳样品中蛋白质磷酸化的变化进行研究。结果表明α-酪蛋白、β-酪蛋白、骨桥蛋白和腱蛋白样蛋白2在哺乳期的含量变化相互独立,首次在人乳中鉴定到腱蛋白样蛋白2的磷酸化。蛋白质组学技术的应用使人乳磷酸化蛋白的研究更为深入,不仅发现新的磷酸化蛋白,同时发现孕期的长短影响人乳蛋白质的磷酸化情况。

3 利用蛋白质组学研究人乳中的内源肽

人乳中的蛋白质进入婴儿体内后一部分被降解为氨基酸供婴儿生长所需,还有部分蛋白质被降解成为肽在婴儿体内发挥生物功能,如酪蛋白磷酸肽结合钙、锌等离子,促进婴儿对钙、锌等元素的吸收;人乳铁蛋白肽具有抑制HIV-1反转录酶活性[23]、抗菌活性[24]。随着越来越多源于人乳蛋白质的活性肽被发现,人乳中的内源肽也逐渐受到关注。以肽为研究对象的肽组学是蛋白质组学的重要分支,肽组学技术的应用促使人乳内源肽的研究进入一个新时期。

Wan等[25]建立了超滤富集人乳内源肽、LC-MS/MS分析的人乳内源肽分析方法,从人乳样品中共鉴定到来源于34个蛋白质的419个内源肽,同时发现内源肽的断裂呈现明显的规律性,说明内源肽是蛋白酶作用的结果;利用二甲基同位素标记定量的方法,比较了早产和足月产乳母的人乳内源肽,发现了两组样品的人乳内源肽存在明显差别。Dallas等[26]利用三氯乙酸法富集、质谱分析的方法研究人乳内源肽,共鉴定到300条内源肽,主要来源于β-酪蛋白,而未鉴定到来源于人乳主要蛋白质α-乳白蛋白和重要蛋白质乳铁蛋白的肽。在所鉴定到的肽中有一部分肽的序列与已知的抗菌肽序列相似,并且首次实验证实人乳内源肽的体外抗菌活性。这是关于人乳内源肽的早期研究,主要集中在样品处理、分析方法的研究,对于研究结果的分析也仅限于内源肽来源蛋白的分析层次。

随着研究的深入,人们的兴趣逐渐转移到人乳内源肽的产生机制方面。Khaldi等[27]利用肽组学技术对产生人乳内源肽的蛋白酶进行了研究。利用三氯乙酸富集、四极杆飞行时间质谱分析的方法研究了两位乳母的人乳内源肽,根据蛋白酶的特异性酶切规律与分析得到的肽进行比对,结果显示人乳内源肽是纤溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、组织蛋白酶、弹性蛋白酶等蛋白酶作用的结果。Dallas等[28]用同样的方法研究了早产和足月产乳母的人乳内源肽,结果显示早产乳母的人乳内源肽的离子丰度、浓度都显著高于足月产乳母的人乳内源肽,纤溶酶在早产乳母乳汁中的活性明显高于在足月产乳母乳汁中的活性。这一现象可能与早产乳母的乳腺发育不成熟有关,也可能是为满足早产儿未发育完全的消化系统所需。Nielsen等[29]利用肽组学技术证明了人乳内源肽是在乳腺内而非在分泌出体外后生成的。研究者将采集的人乳样品立刻加入抗蛋白酶并冷冻保存,以避免样品泌出体外后再发生降解。利用肽组学方法对4位乳母的人乳内源肽进行分析,共鉴定到来源于42个蛋白质的1 100个非冗余肽,说明人乳内源肽是在乳腺中就已形成的;利用蛋白酶预测软件对鉴定到的肽进行分析,结果显示人乳内源肽的降解大多是纤溶酶作用的结果;在鉴定到的内源肽中有306个肽与数据库中的已知活性肽序列80%相似,说明人乳内源肽中可能存在大量潜在的活性肽。除了对早产和足月产乳母的人乳内源肽进行研究,Cui等[30]利用肽组学的方法研究了产巨大儿和非巨大儿的乳母的人乳内源肽,共鉴定到来源于34个蛋白质的400条肽段,其中29条肽存在差异,产巨大儿和非巨大儿的乳母的人乳内源肽的差异可能是为了满足巨大儿的生理需求。

人乳内源肽进入婴儿消化道后能否抵御消化道酶的降解,是决定内源肽能否在婴儿体内发挥作用的关键因素,因此肽组学技术也应用于对人乳内源肽消化过程的研究。Holton等[31]利用肽组学技术对人乳中的内源肽以及人乳经婴儿胃消化2 h后产生的肽谱进行分析,结果发现大部分肽经过婴儿胃消化后依然保持完整的结构,部分内源肽被进一步降解,同时乳蛋白经过消化道蛋白酶的作用又释放出一些新的肽。通过肽谱比对研究人乳中7种典型蛋白酶在消化道中的活性,结果显示在人乳中具有活性的蛋白酶经过婴儿胃消化后依然表现活性,纤溶酶和胰蛋白酶在胃中的活性明显高于其在人乳中的活性。人乳中的活性肽和活性蛋白质对于婴儿早期的免疫系统形成至关重要[32],因此以上人乳肽组学的研究中大多都对潜在的活性肽进行了探讨[23,26,30,33,34], Sun等[35]和Zhang等[36]从内源肽中发现了一些新的抗菌、降血压活性肽。目前鉴定到的人乳内源肽绝大多数都来源于酪蛋白,鲜少鉴定到来源于乳清蛋白的内源肽,这样的结果是自然选择结果还是技术原因造成的还需进一步研究。

4 人乳蛋白质的研究在健康领域的应用

人乳蛋白质组学的研究不仅与婴儿营养相关[2],还应用于婴儿过敏[37]、乳母乳腺炎和乳腺癌等疾病[38]以及人类性别蛋白质组学的研究。

人乳中含有多种与过敏症状相关的免疫组分,人乳中IgG-抗原免疫复合物、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白已被证实与过敏和哮喘发病有关[39],人乳中的一些细胞因子如转化生长因子-β(TGF-β)和白细胞介素-10(IL-10)对患哮喘的儿童有明显的保护作用[40]。Hettinga等[41]使用蛋白质组学技术研究了过敏性和非过敏性乳母的乳蛋白质,在鉴定到的364个蛋白质中有19个在两组人乳样品中存在浓度差异,其中在过敏性人乳中的浓度高于非过敏性人乳中的浓度的蛋白质有:半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂和载脂蛋白。人乳中过敏相关蛋白质的研究将为过敏治疗药物的开发提供依据。

当母亲乳腺感染或者身体发生感染时,人乳中会相应地出现免疫和防御蛋白质,因此人乳蛋白质的变化不仅与哺乳期相关,同时也反映了母亲自身的健康状况。利用蛋白质组学研究人乳蛋白质可以追溯到母亲的乳腺炎、乳腺癌等疾病情况。Aslebagh等[5]利用蛋白质组学技术研究了患乳腺癌前后、乳腺癌患者与非乳腺癌患者的乳中蛋白质的差异,发现一些蛋白质在组别之间确实存在显著性差异,说明对人乳蛋白质组的研究有可能应用于早期乳腺癌的诊断及风险评估。

人乳是女性乳房分泌物,人乳蛋白质组学的研究揭示了女性器官的蛋白质,因此人乳蛋白质组学的研究也是性别蛋白质组学(gender proteomics)的一部分,相关的内容可参考综述[42]。

5 展望

蛋白质组学技术在人乳蛋白质及相关疾病领域的应用研究取得了一些进展,但乳样品组成复杂、样品间个体差异大、数据处理量大等问题使人乳蛋白质的研究还不够深入。对人乳糖蛋白质组学的研究目前仅停留在对不同糖蛋白位点的研究,对其功能及糖链结构的研究还未深入开展;对内源肽的研究多集中于其产生机制,对其功能及与婴儿健康的相关性研究尚属空白。再者,还未见针对人乳特点的特异性蛋白质组学技术和方法,导致了目前人乳蛋白质组学研究结果存在很大局限,如人乳内源肽的研究中均未检测到来源于高丰度乳清蛋白的肽,是分析方法的限制还是生理原因造成的还需进一步确认。总之,建立人乳蛋白质特异性的分析检测方法和数据处理方法,是人乳蛋白质的未来研究方向。

人乳成分中除蛋白质外还有丰富的糖、脂肪等宏量营养素以及维生素、矿物质等微量营养素,将蛋白质组学与脂组学、糖组学等组学技术相结合,开展人乳进化、发育、母婴健康与疾病的研究,形成人乳系统生物学体系,将从更深层次揭示人乳生物学特性,研究成果对于改善人类生命初期营养健康具有重要意义。