秦岭大熊猫肠道益生菌的分离鉴定

张 曼，潘广林，梁武龙，王 华，李 然，张 瑞，柴 佳，叶 超，张耀相，刘再超

(1.杨凌职业技术学院动物工程学院，陕西杨凌 712100;2.陕西省珍稀野生动物抢救饲养中心，陕西周至 710402;3.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100;4.北京市顺义区动物卫生监督所，北京 101300)



秦岭大熊猫肠道益生菌的分离鉴定

张 曼1，潘广林2，梁武龙3，王 华3，李 然3，张 瑞3，柴 佳3，叶 超3，张耀相3，刘再超4*

(1.杨凌职业技术学院动物工程学院，陕西杨凌 712100;2.陕西省珍稀野生动物抢救饲养中心，陕西周至 710402;3.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100;4.北京市顺义区动物卫生监督所，北京 101300)

为研究大熊猫肠道益生菌，从陕西省珍稀野生动物抢救饲养中心无菌采集健康大熊猫新鲜粪便数份，通过微生物学方法分离大熊猫肠道益生菌并进行鉴定。结果从粪便中分离到3株革兰阳性杆菌和2株革兰阳性球菌，经生物学特性、生化试验鉴定，3株革兰阳性杆菌分别为蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和凝结芽胞杆菌，2株革兰阳性球菌分别为酵母菌和粪链球菌。用5株分离菌分别给小鼠腹腔注射0.2mL或灌胃0.5mL，家兔先腹腔注射2mL再灌胃5mL，隔离饲养72h，小鼠和家兔均未发病，表明分离菌均为益生菌，可用于大熊猫益生菌制剂的后续研究。

大熊猫；粪便；益生菌；分离鉴定

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是食肉目大熊猫科的一种哺乳动物，为我国特有的国家一级保护动物，主要生活在我国四川、陕西和甘肃的山区。目前野生大熊猫不足1600只，属于珍稀濒危动物之一。大熊猫最初为肉食性动物，经过长期的进化与自然选择，现在虽然其食物主要为竹子，但其牙齿和消化道仍保持着原有的特征，因此仍然划分在食肉目[1-2]。

肠道是动物机体最主要的消化器官，负责食物营养素的消化吸收。肠道中的原籍微生物和外籍微生物与肠上皮细胞、未被消化的食物、食物残渣及消化器官分泌的胆汁、消化酶、黏液、激素等共同组成动物肠道内环境。哺乳动物肠道内的细菌数量占食物残渣绝大部分，以不致病的益生菌为主，主要有大肠杆菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌，双歧杆菌、固氮菌等。这些益生菌可以产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、腐殖酸酶及B族维生素，进一步分解动物肠道内的食物残渣，使动物便于吸收利用和排出粪便，对动物的生长发育起一定的促进作用[3-4]。与益生菌并存于动物肠道的有一定量的条件致病菌，如产气荚膜梭菌、致病性大肠杆菌、绿脓杆菌等。这些益生菌和条件致病菌共生，将动物肠道食物残渣继续进行分解，肠道内细菌和动物相处在一个和谐共同受益的环境中，称共生生物[5-6]。

大熊猫作为我国特有的一种珍稀野生动物，其肠道内主要共生着哪些益生菌，使其在长期的进化过程中形成了特有的饮食特征，目前相关的研究报道较少。本研究从陕西省秦岭大熊猫繁育基地随机无菌采集健康大熊猫新鲜粪便数份，采用微生物学方法从粪便中分离鉴定大熊猫肠道的益生菌，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1 材料

1.1.1 样品 健康大熊猫粪便若干份，采自陕西省秦岭大熊猫繁育基地，低温下2h内带回实验室进行细菌分离。

1.1.2 主要试剂 普通肉汤、普通琼脂平板、沙堡弱氏液体培养基、沙堡弱氏琼脂平板、乳酸菌平板、绵羊血琼脂平板，各种生化试验用培养基均参考文献[7]制备。药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3 试验用动物 健康小鼠和家兔，西北农林科技大学动物医学院实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 取适量新鲜大熊猫粪便无菌操作接种普通肉汤，37℃培养24h后高温处理20min，再划线接种普通琼脂平板和绵羊血琼脂平板，37℃培养18h～24h；另取适量新鲜大熊猫粪便接种含有一定抑菌剂的沙堡弱液体培养基，28℃培养24h～36h后，取培养液划线接种于沙堡弱琼脂平板，28℃ 培养24h；再另取部分新鲜粪便分别接种普通肉汤和乳酸菌肉汤，37℃培养 24h进行增菌，然后取增菌培养液接种于乳酸菌平板及绵羊血琼脂平板。挑取各琼脂平板上的疑似菌落接种于相应斜面，37℃或28℃培养24h获得纯培养的疑似菌，4℃保存备用。

1.2.2 分离菌培养特性鉴定 将相应斜面上的纯分离菌分别接种到普通琼脂平板、绵羊血琼脂平板、沙堡弱琼脂平板、乳酸菌平板等进行培养，观察培养特征，并挑取单菌落进行革兰染色镜检。

1.2.3 分离菌生理生化试验 分离菌的生理生化试验参考文献[7-8]的方法进行。

1.2.4 分离菌的动物致病性试验 将获得的分离菌分别接种于相应液体培养基中，37℃或28℃培养24h后，用比浊管测定菌液浓度。将36只小鼠随机分为2组，一组为腹腔注射组，另一组为灌服组。腹腔注射组0.2mL/只，灌服组0.5mL/只，每株分离菌注射3只、口服3只，另外3只作为正常对照隔离饲养，连续观察 7d。家兔致病性试验腹腔注射分离菌液体培养物 2mL/只，灌服 5mL/只。腹腔注射后隔离饲养，连续观察 3d。如未见异常则进行灌服试验，继续观察7d。观察时注意小鼠和家兔的食欲、精神等是否出现不良反应。

1.2.5 药敏试验 参照文献[9]方法进行分离菌的药敏试验。根据抑菌环直径大小，判断细菌对相应抗菌药物的敏感程度。试验中用到的药敏纸片有复方新诺明、万古霉素、头孢曲松、阿米卡星、诺氟沙星、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢吡肟、克拉霉素、大观霉素、四环素、麦迪霉素、苯唑西林、哌拉西啉、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、左氟沙星、米诺霉素、氯霉素、卡那霉素、头孢噻吩、氨苄西林、青霉素、氧氟沙星、头孢他啶、氨曲南、头孢西丁、妥布霉素、克林霉素、呋喃妥因等。

2 结果

2.1 细菌分离结果及分离菌生物学特性

共分离到3株革兰阳性杆菌和2株革兰阳性球菌，3株革兰阳性杆菌分别用YM-1、YM-2和YM-3；2株革兰阳性球菌分别用XM-1和YU-1表示，它们的生物学特性如下：

YM-1，革兰阳性大芽胞杆菌，镜检时单个或长链状排列，芽孢位于菌体末端，无菌毛，无荚膜。普通琼脂平板上37℃培养 24h，形成灰色、表面干燥、扁平、有皱纹、边缘不整齐的大菌落；在绵羊血琼脂平板上形成β溶血，形态特征与普通琼脂平板上的一致。

YM-2，革兰阳性短小芽胞杆菌，镜检时散在排列，芽孢位于菌体中心，无菌毛、无荚膜。普通琼脂平板上37℃培养 24h，形成灰白色、表面光滑湿润、圆形凸起、边缘整齐的大菌落；在绵羊血琼脂平板上形成β溶血，形态特征与普通琼脂平板上的一致。

YM-3，革兰阳性小芽胞杆菌，镜检时散在排列，芽胞位于菌体次末端，无菌毛，无荚膜。普通琼脂平板上37℃培养 24h ，形成灰白色、表面光滑湿润、圆形凸起，边缘整齐的中等大小菌落；在绵羊血琼脂平板上形成β溶血，形态特征与普通琼脂平板上的一致。

XM-1，革兰阳性大球菌，镜检时散在排列，有芽生现象，老龄培养菌呈革兰阴性球菌，无芽胞，无菌毛，无荚膜。在沙堡弱平板37℃培养 24h，大菌落，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐。

YU-1，革兰阳性链状球菌，镜检时呈球形链状排列，老龄菌为革兰阴性，血清肉汤中的培养物镜检时呈长链状排列。在乳酸菌琼脂平板上37℃培养 24h，形成圆形、透明、湿润、边缘整齐的小菌落；在绵羊血琼脂平板上形成α溶血，传代次数多时无溶血现象。

2.2 分离菌生化试验结果

YM-1、YM-2和YM-3的生理生化试验鉴定结果见表1。结合表1结果，参考文献[9-10]可以得出，YM-1生理生化试验结果符合蜡样芽胞杆菌，YM-2生理生化试验结果符合凝结芽胞杆菌，YM-3生理生化试验结果符合枯草芽胞杆菌。

XM-1的生理生化试验鉴定结果见表2。结合表2结果，参考文献[10]，XM-1生理生化试验结果符合粪链球菌特征。

YU-1在好氧条件下培养时生长缓慢且发酵葡萄糖有淡淡的醋酸味，其芽殖呈尖状，初步确定属于酒香酵母菌属或德克酵母属或伊尼拉酵母属，其生理生化试验结果见表3。结合表3结果，参考文献[10-11]，YU-1基本符合德克酵母属的间型酵母菌特征。

2.3 药敏试验结果

对 YM-1、YM-2、YM-33株分离菌进行药敏试验，根据药敏纸片判断标准，YM-1对氨曲南、氨苄西林、苯唑西林、头孢噻肟、多黏菌素、青霉素、复方新诺、头孢呋辛、头孢他啶均有一定的耐药性；对庆大霉素、红霉素、氯霉素、左氟沙星、头孢曲松、米诺霉素、环丙沙星、头孢吡肟、万古霉素、阿米卡星等都敏感。YM-2对头孢曲松、氨曲南、头孢噻肟、氨苄西林、头孢他啶、头孢吡肟、多黏菌素、青霉素、复方新诺、头孢呋辛都呈现较强的耐药性；对米诺霉素、头孢哌酮、红霉素、四环素、万古霉素、氯霉素、克拉霉素、克林霉素、阿米卡星都高度敏感。YM-3对头孢噻吩、氨苄西林、氨曲南、多黏菌素、复方新诺、苯唑西林、头孢呋辛、头孢吡肟都具有一定耐药性；对红霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素、左氟沙星、头孢吡酮、氧氟沙星、克拉霉素都有较高的敏感性。

YM-1、YM-2、YM-33株分离菌对氨曲南、氨苄西林、多粘菌素、复方新诺、头孢呋辛等均不敏感。

表1 分离芽胞菌生化试验结果Table 1 Biochemical test results of isolated Bacillus

表2 XM-1生化试验结果Table 2 Biochemical tests results of XM-1

表3 YU-1生化试验结果Table 3 Biochemical tests results of YU-1

2.4 动物致病性试验结果

采用麦氏浊法测定各分离菌菌液浓度如表4。

表4 各分离菌菌液浓度Table 4 Concentrations of bacterial solution of all isolated bacteria 个/mL

正常对照小鼠隔离饲养期间全部健康存活，蜡样芽胞杆菌注射组中小鼠3h内死亡1只，同组另2只小鼠存活。口服蜡样芽胞杆菌的小鼠12h内出现呆立、扎堆、精神萎靡、食欲不振等不良现象，48h后恢复正常。枯草芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、酵母菌、粪链球菌注射、灌服组小鼠均存活，注射组未出现不良反应，灌服组在12h内出现了呆立、扎堆、精神萎靡等不良现象，但48h后不良现象均消失，饮食、精神恢复正常。

所有家兔在注射5株分离菌后均存活，连续观察3d，无不良反应出现；再接着灌服相应分离菌株，12h内出现轻微精神萎靡、呆立，但对饮食影响不明显，24h后以上不良现象均消失。

3 讨论

大熊猫为草食动物，其肠道存在着大量益生菌，这些益生菌为动物生长发育提供了很好的条件，它们产生的蛋白酶、淀粉酶、酸性物质、B族维生素等分解动物肠道食物残渣，便于动物再次吸收利用，促进动物生长。临床上，益生菌主要用于动物胃肠道菌群失调和某些肠胃疾病的治疗。

用分离到的5株菌进行小鼠和家兔致病性试验，注射蜡样芽胞杆菌的小鼠死亡1只，将小鼠解剖后未见小鼠有异常症状，推测可能是操作不当引起的；虽然灌服组的小鼠和家兔在灌服后12h内出现了呆立、扎堆、精神萎靡等不良现象，但随后不良现象均消失，饮食、精神恢复正常，这种不良现象应该是应激反应造成的。小鼠和家兔致病性试验结果进一步说明这些分离菌为大熊猫肠道的益生菌。

谭志等[12]指出，大熊猫在以精饲料为主食的圈养期间，肠道内的肠杆菌和乳酸菌的数量较多，通过肠杆菌和乳酸菌对多糖、蛋白质的分解,有利于肠道黏膜对乳糖、乳蛋白等高蛋白性食物的消化吸收和利用。在大熊猫以高纤维性的竹子为主食后，肠道微生态平衡发生波动,细菌种类和分布发生变化，肠球菌增多，有利于在厌氧环境下肠球菌对纤维性食物的分解和利用。本次研究却没有从圈养的大熊猫粪便中分离到乳酸杆菌、双歧杆菌及其他益生菌。熊焰等[13]研究表明，季节变化和年龄对大熊猫肠道内细菌的含量有一定的影响，本研究采样的月份为3月份，采集样品的大熊猫主要为成年大熊猫。大熊猫肠道是否有存在乳酸杆菌、双歧杆菌及其它益生菌？还是季节和年龄因素造成没有分离到这些益生菌有待进一步研究。

细菌素是细菌自身生产的一类杀菌物质,由基因编码、核糖体合成,是自然界中细菌用于调节自身菌群结构的一类重要活性物质。大量体外试验结果表明,细菌素对食源性(如李斯特菌、空肠弯曲菌、沙门菌、大肠埃希菌等)、植物源性、动物源性条件致病菌(沙门菌、大肠埃希菌等)、人源性(抗药菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等)等各种临床致病菌都具有良好的抑杀作用[14]，体内试验结果也表明，细菌素能在体表用药来治疗由体表感染所致各种炎症[15]。一些研究已经表明，将产细菌素的菌株制备成益生素活菌制剂或将细菌素作为饲料添加剂，可明显提高动物生长速度和饲料利用率[16]。本试验分离到的益生菌为大熊猫这方面的研究奠定了基础。

经药敏试验证实3株分离的芽胞杆菌对庆大霉素、红霉素、氯霉素、四环素、氧氟沙星、克林霉素、万古霉素、阿米卡星等敏感，在今后大熊猫饲喂中应尽量避免添加这类抗生素。

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Isolation and Identification of Probiotics from Giant Pandas in Qinling Mountains

ZHANG Man1,PAN Guang-lin2,LIANG Wu-long3,WANG Hua3,LI Ran3,ZHANG Rui3,CHAI Jia3,YE Chao3,ZHANG Yao-xiang3,LIU Zai-chao4

(1.CollegeofAnimalEngineering，YanglingVocational&TechnicalCollege，Yangling,Shaanxi,712100,China；2.ShaanxiWildAnimalRescueandBreedingCenter,Zhouzhi,Shaanxi,712100,China；3.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China;4.BeijingShunyiDistrictAnimalHealthSupervision,Beijing,101300,China)

For the study of giant pandas intestinal probiotics,faeces of healthy panda from Shaanxi Wild Animal Rescue and Breeding Center were obtained sterilely.Three strains which were Gram-positive bacilli were isolated and identified asBacilluscereus，BacillussubtilisandBacilluscoagulansthrough biological characteristics and biochemical tests.Additionally,through the experiments of biological characteristics and biochemistry,two strains which were Gram-positive cocci were identified asSaccharomycesandStreptococcusfaecalis.Experiments of intraperitoneal injection of 0.2mL or gavage of 0.5mL to mice and intraperitoneal injection of 2mL and gavage of 5mL to rabbits showed that the isolates are all probiotics and can be used for the following study of the giant panda probiotic preparations.

giant panda; feces; probiotics; isolation and identification

2015-04-09

西北农林科技大学大学生科技创新项目；科技创新与成果转化(Z222021310)

张 曼(1979-)，女，陕西泾阳人，副教授，博士，主要从事临床兽医与兽药制剂研究。*通讯作者

S865.31

B

1007-5038(2016)01-0125-05