一例神农架金丝猴头部脓肿的诊断

陈伟贞，余辉亮，李 悦，赖金伦，周飞燕，韩 丽，胡长敏，李 翔，熊家军，丁明星，陈建国*

(1.华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070；2.湖北神农架国家级自然保护区管理局 442421；3.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070；4.华中农业大学遗传育种教育部重点实验室，湖北武汉 430070)



一例神农架金丝猴头部脓肿的诊断

陈伟贞1，余辉亮2，李 悦3，赖金伦1，周飞燕1，韩 丽1，胡长敏1，李 翔4，熊家军4，丁明星1，陈建国1*

(1.华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070；2.湖北神农架国家级自然保护区管理局 442421；3.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070；4.华中农业大学遗传育种教育部重点实验室，湖北武汉 430070)

神农架金丝猴为我国一级保护动物，做好金丝猴疾病的预防与治疗工作非常重要。论文针对一例神农架笼养金丝猴由于头部脓肿引起死亡的病例开展研究。首先对病变组织进行石蜡切片和HE染色，然后对脓液进行细菌分离鉴定，并对分离纯化的菌株进行药敏试验。结果显示,病变组织为增生的组织，此脓肿是由金黄色葡萄球菌感染而引起的，所分离的金黄色葡萄球菌对恩诺沙星、阿奇霉素、复方新诺明、优孢欣、左氧氟沙星、氨苄西林、头孢唑林、氯霉素、氧氟沙星、头孢哌酮、环丙沙星均敏感，对青霉素、林可霉素耐药。此结果可以为金丝猴疾病的预防与治疗提供参考。

金丝猴；脓肿；诊断；金黄色葡萄球菌

川金丝猴是我国特有的珍贵物种，数量稀少，总数量约为1.5万只[1]，为国家一级保护动物。川金丝猴主要分布于四川、甘肃、陕西和湖北地区，共有3个亚种[2]，以家庭为单位群居生活，主要集中在海拔1500m ～3500m的针阔混交林和针叶林内，为树栖生活，喜跳跃。神农架金丝猴为川金丝猴的一个独立亚种，分布在湖北省神农架林区，在川金丝猴分布的最东端，分为3个大群体，8个小种群，仅有1282只。其中笼养金丝猴有4个家庭15只。

金丝猴临床疾病的报道，有对中暑[3]、消化道类疾病[4]、腹壁透创[5]等疾病的治疗，川金丝猴感染方面的报道主要有多杀性巴氏杆菌[6]、寄生虫[7]等感染。目前为止还未见到关于金丝猴头部脓肿的有关报道。本研究针对神农架繁育中心的1只金丝猴因头部脓肿而死亡的病例进行了系统研究，对病变组织进行组织切片和HE染色，观察组织病理学变化，然后对引起脓肿的病原菌进行细菌的分离鉴定和药敏试验，从而探讨引起此次金丝猴发病的主要病因，为今后更好的保护金丝猴提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 神农架人工繁育中心的1只雄性金丝猴，7周岁，体重为15kg。

发病情况：2014年10月该金丝猴左侧额部肿胀，1周之后破溃，有脓液流出，工作人员为排脓，用生理盐水清理。之后，破溃面积越来越大，无愈合现象，肿块的体积变大，并且蔓延至左侧脸颊，致使嘴巴不能张开，不能进食,进行手术。手术前发现该猴精神沉郁，头部左侧额头上方有一直径约8cm大的脓肿(图1)，体温36.5℃，麻醉输液强心进行排脓手术，但术后不幸多器官衰竭死亡。

图1 头部脓肿
Fig.1 Head abscess

1.1.2 主要材料与试剂 Leica RM2016切片机为莱卡公司产品；药敏试纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品；DNA提取试剂盒为美国OMEGA公司产品；引物由武汉擎科生物公司合成；测序在武汉擎科生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 石蜡切片的制作 金丝猴死亡后，用手术刀切开脓肿，观察到里面有大量的增生组织，切取2cm～3cm长宽的组织，立即放入100mL/L的福尔马林中固定，然后带回实验室。按常规程序制作石蜡切片，并对切片进HE染色。

1.2.2 病原菌的分离与鉴定 脓肿部位的病变组织收集到无菌的离心管中，带回实验室，将组织涂于固体培养基(TSA)上进行细菌培养。将培养出的菌落挑取出来，继而用TSA进行纯化，并且用伊红美蓝和Baird-Parker培养基进行鉴定。

1.2.3 16S rDNA的PCR扩增和测序鉴定 Baird-Parker培养基上有菌落生长，怀疑为金黄色葡萄球菌，挑取此菌落，参照文献[8]，用DNA提取试剂盒提取菌落的DNA，选取金黄色葡萄球菌的特异性耐热核酸酶nuc基因序列，应用Primer5.0软件设计1对引物序列为：nucF：5′-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC-3′；nucR：5′-AAAGGGC- AATACGCAAAGAGGT-3′。PCR扩增体系为25μL：Premix 12.5μL，P1/P2各2μL，DNA模板2μL，超纯水6.5μL。反应条件如下：94℃ 5min;94℃ 60s，50℃ 30s，72℃ 60s，30个循环;然后72℃ 10min。反应产物用12g/L凝胶电泳检测。并将阳性扩增产物送至武汉擎科生物公司测序。

1.2.4 药敏试验 采用纸片法对分离出的细菌进行药敏试验，选用的药物分别是青霉素、林可霉素、恩诺沙星、阿奇霉素、链霉素、卡那霉素、复方新诺明、优孢欣、左氧氟沙星、氨苄西林、头孢唑啉、氯霉素、氧氟沙星、头孢哌酮、环丙沙星。

2 结果

2.1 组织切片HE染色

由HE染色的结果(图2和图3)可知，染色之后的细胞可看到组织呈絮状，空泡现象明显，未见完整有序的细胞形态，可看到细胞核，但是未见到核分叶现象，有大量的血细胞。说明此组织为增生的组织，未有癌变发生。

2.2 病原菌的分离与鉴定

TSA和Baird-Parker培养基中均长出菌落，TSA中长出2mm～3mm的白色湿润菌落(图4)，Baird-Parker菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色菌株，边缘为淡色，周围有浑浊带外层有透明圈的菌落(图5)。伊红美蓝培养基上无生长菌落。初步判定此菌落为金黄色葡萄球菌。

图2 HE染色的组织切片
Fig.2 Tissue section of HE staining

图3 HE染色的组织切片
Fig.3 Tissue section of HE staining

图4 TSA培养基上分离的菌落
Fig.4 The bacterial colony on TSA medium

图5 Baird-Parker培养基上分离的菌落
Fig.5 The bacterial colony on Baird-Parker medium

2.3 16S rDNA的PCR结果和序列测定

提取疑似金黄色葡萄球菌的菌落的DNA，然后用特异性引物进行PCR扩增，扩增之后用12g/L的琼脂糖凝胶进行电泳。由图6可知菌落均能够扩增出484bp的产物。将扩增产物测序，将测序结果放于GenBank中比对，符合度为99%,证明该菌落是金黄色葡萄球菌。

M.DNA标准DL 2000；1～4.PCR产物；5.阴性对照
M.DNA Marker DL 2000; 1-4.PCR products; 5.Negative control

图6 金黄色葡萄球菌nuc基因PCR扩增结果
Fig.6 PCR amplification of nuc gene ofStaphyloccocusaureus

2.4 药敏试验结果

依据表1药敏试验的结果可知，所分离的金黄色葡萄球菌对恩诺沙星、阿奇霉素、复方新诺明、优孢欣、左氧氟沙星、氨苄西林、头孢唑林、氯霉素、氧氟沙星、头孢哌酮、环丙沙星均敏感，而对青霉素、林可霉素耐药。

表1 分离鉴定的金黄色葡萄球菌对15种药物的耐药性Table 1 Drug resistance of Staphylococcus aureus to 15antimicrobial agents

3 讨论

由于金丝猴的数量稀少，并且其繁殖率低，每减少一只对我们国家来讲都是一个很大的损失，所以做好金丝猴疾病的预防、诊断与治疗工作非常重要。

试验结果表明，该金丝猴的死亡主要是由金黄色葡萄球菌感染引起的头部脓肿，脓肿蔓延至脸部，从而致使此个体不能进食，身体极度消瘦，最终导致其死亡。

金黄色葡萄球菌是人和动物的一种重要的病原菌，侵袭力强，产生的毒素、酶种类多，毒力强，既可引起局部化脓感染，比如奶山羊的乳房炎[9]、人的角膜炎[10]等，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等严重感染[11]，并且其预防比较困难[12]。人和动物的带菌率较高，主要寄生在人体的皮肤、头发、咽喉、鼻腔等，易经手污染食品[13]。本试验中的金丝猴生活在神农架自然保护区的繁殖中心，平时较少与外界人员接触，每天由饲养员按时饲喂，所以此金丝猴的感染可能是由于饲养员在准备、饲喂食物的过程中把自身携带的细菌传染给金丝猴。

王登峰等[14]对我国牛源的金葡菌的耐药性进行研究结果表明金葡菌对抗生素的耐药现象严重，且多呈现多重耐药现象。王凤等[15]从奶牛乳房炎中分离的金葡菌对青霉素和氨苄西林的耐药率高达81.25%以上。巢国祥等[13]对食源性的金葡菌耐药性进行分析，发现其对青霉素、四环素、凝固酶阴性、苯唑西林耐药率分别高达93.10%、49.43%、37.93%和79.31%,且多呈现2种以上混合的耐药性。该药敏试验结果可知，此金黄色葡萄球菌对青霉素和林可霉素耐药，对恩诺沙星、优孢欣、头孢唑林、氯霉素、氧氟沙星等均敏感，这与其他动物源的金黄色葡萄球菌的耐药性相比较，此试验中分离的金黄色葡萄球菌耐药性比较低，分析其原因，由于金丝猴为野生动物，不经常使用抗生素，故不易产生耐药性。对青霉素、林可霉素耐药，可能是游客投递食物造成的。这种现象在其他野生动物的研究中也有发现，比如权自芳等[16]生活于旅游景区内的赤腹松鼠肠道细菌分离鉴定结果表明金黄色葡萄球菌的检出率较高为84.85%，但是此菌仅对大观霉素耐药。

做好金丝猴的预防与治疗工作非常重要，鉴于本研究的检测结果，建议饲养员以后在给金丝猴准备食物的过程中一定要带手套，食物尽量用新鲜的、干净的饲喂，不可饲喂霉烂的食物。在发生疾病的时候，可使用恩氟沙星、氧氟沙星等喹诺酮类药物对其进行治疗。严禁游客投递食物。

[1] Chang Z F,Liu Z J,Yang J Y,et al.Noninvasive genetic assessment of the population trend and sex ratio of the Shennongjia population of Sichuan snub-nosed monkeys (Rhinopithecusroxellana)[J].Chinese Sci Bul,2012,57(10):1135-1141.

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[4] 寿晓玲,王才益,杜爱芳.杭州动物园川金丝猴消化道疾病的防控研究[J].浙江畜牧兽医,2014,39(3):41-42.

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Diagnosis for a Case Head Abscess of Shennongjia Golden Monkey

CHEN Wei-zhen1,YU Hui-liang2,LI Yue3,LAI Jin-lun1,ZHOU Fei-yan1,HAN Li1,HU Chang-min1,LI Xiang4,XIONG Jia-jun4,DING Ming-xing1,CHEN Jian-guo1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070，China; 2.ManagementBureauofShennongjiaNationalNatureReserve,Wuhan,Hubei,442421，China; 3.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070，China; 4.KeyLaboratoryofAnimalBreedingandReproduction,MinistryofEducation,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

Shengnongjiao golden monkey is the first class of protected animal,the prevention and treatment of diseases in this species are very important.This research studied a dead captive gold monkey with head abscess.The paraffin sections of pathological tissue were stained with HE.The bacteria in pus were isolated and identified.The isolated and purified stain was used to do the drug sensitivity test.The results showed that the pathological tissue was hyperplasia tissue,and the abscess was caused by the infection ofStaphylococcusaureus.The results of drug sensitivity showed thatStaphylococcusaureuswas sensitive to enrofloxacin,azithromycin,sulfamethoxydiazine,ubrolexin,levofloxacin,ampicillin,cefazolin,chloramphenicol,ofloxacin,cefoperazone and ciprofloxacin,and was resistant to penicillin and lincomycin.This results can provide help for the prevention and treatment of the disease in golden monkey.

golden monkey; abscess; diagnosis;Staphylococcusaureus

2015-07-02

国家支撑计划项目(2013BAD03B01)

陈伟贞(1989-),女,河南洛阳人,硕士,主要从事临床兽医学研究。*通讯作者

S865.31

B

1007-5038(2016)01-0133-04