西方马脑炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

郑小龙，王 群，邓明俊，张晓文，孙明君，朱来华

(山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002)



西方马脑炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

郑小龙，王 群，邓明俊，张晓文，孙明君，朱来华

(山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002)

通过RT-PCR从西方马脑炎病毒(WEEV)中扩增得到1317bp特异的保守序列，将其克隆到pMD-20T载体中，进行体外转录，制备标准品cRNA。以10倍比稀释的cRNA为模板，进行TaqMan MGB荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线，建立了WEEV荧光定量RT-PCR检测方法。对建立的方法进行了特异性和敏感性试验。结果表明，建立的荧光定量RT-PCR方法最低可检测10拷贝的cRNA；且与马鼻肺炎病毒(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)、马流感病毒(EIV,H3N8)、西尼罗病毒(WNV)、东方马脑炎病毒(EEEV)和日本脑炎病毒(JEV)不发生交叉反应。与常规RT-PCR相比，该方法更加快速，特异性和敏感性更高,灵敏度为常规RT-PCR方法的100倍。

西方马脑炎病毒；TaqMan MGB；荧光定量RT-PCR

西方马脑炎病毒(Wastern equine encephalitis virus,WEEV)属于披膜病毒科甲病毒属，是引起西方马脑炎的病原体。该病毒可经呼吸道传播感染，但主要通过蚊虫传播[1]。西方马脑炎可引起人和马发病，病马常呈亚临床症状，病死率低于30%；WEEV对人的致死率明显低于东方马脑炎病毒[2-5]。该病在北美西部呈地方性流行，主要分布于加拿大、美国西部和中部，南美一些国家也有该病发生，如巴西、阿根廷、智利、秘鲁和乌拉圭等国家[6]。

西方马脑炎在我国也有报道，1990年何海怀等[7]从新疆乌苏县采集的按蚊和博乐县采集的全沟硬蜱中分离出WEEV。吕新军等[8]在对我国人体血清调查中发现，WEEV抗体的阳性率为2.71%，但在马属动物中的流行情况未见相关报道。随着我国马术运动的发展，国际马术比赛的日益频繁，我国进出境马匹的数量也在不断增加。为保障我国养马业的健康发展，保证国际赛事的顺利进行，建立快速、敏感、特异的WEEV 荧光定量RT-PCR检测方法十分必要。本试验针对WEEV E1基因，筛选高度保守的片段，设计引物和探针，建立WEEVTaqMan MGB 荧光定量RT-PCR，并对其敏感性和特异性进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及核酸 马鼻肺炎病毒(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)、马流感病毒(H3N8)、西尼罗病毒(WNV)RNA、东方马脑脊髓炎病毒(EEEV)RNA、西方马脑炎病毒(WEEV)RNA和日本脑炎病毒(JEV)RNA均由山东检验检疫技术中心实验室保存。

1.1.2 临床样品 荷兰进口马血样18份，美国进口马血样12份，俄罗斯进口马血样12份，由山东检验检疫技术中心实验室收集并保存。

1.1.3 试剂 DNA/RNA提取试剂盒、连接试剂盒、DH5α、pMD20T和DNA Marker DL 2000均为TaKaRa公司产品；One-step RT-PCR试剂盒、TaqPCR mastermix为Qiagen公司产品；TaqMan RT- PCR试剂盒为ABI公司产品；SP6RiboMax Large Scale RNA Production System为Promega公司产品；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物、探针的设计与合成 根据GenBank公布的WEEV基因序列，利用Mega 5.0软件进行分析，选择保守区域，利用Primer Express 5.0软件设计引物，用于标准阳性模板的制备。引物序列：T1:5′-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3′；T2:5′-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3′。根据荧光定量RT-PCR要求，利用Primer Express 3.0软件在选取的保守区域内设计荧光定量RT-PCR引物和探针。引物和探针序列：P1：5′-GCGGGTCCCTCGAGTGTAA-3′；P2：5′-CAAAAACGCGGCATGTGTAA-3′；Probe：5′-NED-CATCCTCAAAGGCG-MGB-3′。引物和探针均由英骏生物科技有限公司合成。

1.2.2 WEEV基因特异性保守片段的扩增 以WEEV RNA为模板，加入适量T1、T2；5×RT-PCR buffer；dNTP和Enzyme mix进行RT-PCR扩增。反应条件为： 50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 10min。反应完毕，取5μL扩增产物，于10g/L琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中以100V电压进行电泳,用凝胶成像系统观察记录结果。

1.2.3 标准阳性模板的制备 用T1和T2引物按照1.2.1的方法进行RT-PCR扩增，将RT-PCR产物按试剂盒说明书进行切胶回收，连接至pMD20-T载体，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，37℃培养过夜，挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，挑选经PCR鉴定正确的重组质粒,送英骏生物科技有限公司测序。将测序正确的重组质粒命名为pMD20T-WEE。

选用限制性内切酶XbaⅠ将重组质粒pMD20T-WEE进行线性化，并纯化回收，用SP6RiboMax Large Scale RNA Production System试剂盒进行体外转录，转录产物经无RNase的DNase消化后除去其中的DNA，然后用RNeasy Kit 进行纯化，制备出所需的cRNA。用核酸蛋白分析仪测定cRNA浓度，计算拷贝数。

1.2.4 荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件的优化 以样本阈值循环数(Ct值)、产物荧光值、标准曲线斜率和相关系数等为标准，分别对荧光RT-PCR反应体系中的引物浓度(100、200、400、600、800nmol/L)，探针浓度(50、100、200、300、400nmol/L)和反应参数中循环数(35、40、45个循环)、反应温度(58、60、62℃)进行优化。

1.2.5 标准曲线的建立 用10倍系列稀释法处理pMD20T-WEE cRNA标准品。取7个浓度梯度 (108、107、106、105、104、103拷贝和102拷贝) cRNA标准品作为模板，以优化好的反应体系和反应参数进行荧光RT-PCR 反应。根据实时荧光RT-PCR 的动力学曲线，检测仪系统自动生成标准曲线及回归方程。

1.2.6 荧光定量RT-PCR方法特异性和敏感性试验 分别提取EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、WEEV和EEEV的核酸，用所建立的荧光定量RT-PCR进行检测，用ddH2O作为阴性对照。收集荧光信号，检测其特异性。

用ddH2O对标准模板进行10×系列稀释，取1copies/μL～1.0×108copies/μL用所建立的荧光定量RT-PCR方法对各个稀释度的样品进行检测，同时应用常规RT-PCR进行检测。

1.2.7 临床样品检测 应用建立的荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR对荷兰进口的马血样18份，美国进口马血样12份，俄罗斯进口马血样12份进行检测。

2 结果

2.1 标准阳性模板的制备

将扩增得到的WEEV基因特异性保守片段克隆至pMD20T载体中，利用体外转录试剂盒制备出所需的cRNA作为阳性模板，对其进行RT-PCR鉴定，得到1317bp的片段(图1)。经序列测定，扩增得到的特异性保守序列与GenBank中登陆序列同源性达到100%。

2.2 荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件确立

为确保荧光定量RT-PCR的高效性、特异性及敏感性，对其反应体系和反应条件进行了优化。由试验结果可知，反应的最佳引物和探针浓度分别为400nmol/L和200nmol/L，反应温度为60℃，反应循环数为45个循环。

2.3 标准曲线的建立

利用试剂盒纯化pMD20T-WEE cRNA标准品，测定其OD值，通过公式计算得到其浓度为2.3×1010copies/μL。稀释cRNA至1.0×1010copies/μL作为母液备用。

标准曲线：把含有1.0×1010copies/μL的cRNA母液10倍比稀释，分别以1×102～1.0×108

copies/μL稀释度的cRNA为标准品进行荧光定量RT-PCR，以起始模板的拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，结果见图2。由图2可知，Ct值与拷贝数浓度在1×102copies/μL～1.0×108copies/μL之间呈线性关系，标准曲线方程式为y=49.28-3.72logx，R2=0.999。

M.DNA 标准DL 2000；1，2.cRNA RT-PCR产物
M.DNA Marker DL 2000；1，2.RT- PCR products of cRNA

图1 cRNA的RT-PCR鉴定
Fig.1 RT-PCR identification of cRNA

图2TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测WEEV的标准曲线
Fig.2 Standard curve of WEEV detected byTaqMan MGB real-time PCR

2.4 荧光定量RT-PCR方法特异性、敏感性

用建立的TaqMan MGB荧光定量RT-PCR方法对EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、WEEV和EEEV阳性样本进行检测，只有WEEV样本呈现扩增曲线(图3)。将cRNA标准品10倍稀释，进行扩增，扩增曲线见图4，由图4可知，所建立的检测方法在10copies/μL时，仍有荧光曲线,拷贝数浓度在1copies/μL时，无扩增。核酸浓度为1.0×103copies/μL时普通RT-PCR后电泳可见到清晰条带(图5)，进一步稀释检测不到目的条带，因此所建立方法的灵敏度为常规RT-PCR方法的100倍。

2.5 临床样品检测结果

用建立的方法对42份进口马血样进行检测，结果显示，阳性对照出现扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，试验成立，42份马血样均未出现扩增曲线，WEEV检测为阴性。同时用普通RT-PCR方法对其检测，二者符合率为100%。

图3 WEEV荧光定量RT-PCR检测方法特异性分析
Fig.3 Analytical specificity of the real-time RT-PCR for WEEV

图4 WEEV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性分析
Fig.4 Analytical sensitivity of the real-time RT-PCR for WEEV

M.DNA 标准DL 2000;1～7.1.0×107copies/μL～1.0×101copies/μL cRNA RT-PCR 产物;8.空白对照
M.DNA Marker DL 2000;1-7.1.0×107-1.0×101copies/μL cRNA RT-PCR products;8.Blank

图5 WEEV RT-PCR检测敏感性分析
Fig.5 Analytical sensitivity of the RT-PCR for WEEV

3 讨论

西方马脑炎是一种人兽共患病，主要通过蚊虫传播给人和马等动物，主要侵袭中枢神经系统，病毒感染率较高，病愈后多留有神经系统后遗症[9]。由于该病属于急性病毒性人兽共患传染病，被国际社会列为生物恐怖的主要病原之一。随着经济全球化的发展，国际间马匹的交流也越来越频繁，建立快速高效敏感的WEEV检测方法，对于保障人们的健康和预防疫情的暴发具有重要意义。

目前，对于WEE的诊断主要是通过病原学和血清学两个方面。病原学诊断虽然可以确诊，但是费时费力，检出率低，且需要在生物安全三级以上实验室中进行操作。血清学诊断中ELISA尚无商品化的试剂盒，血凝抑制试验受主观因素影响较大，而且血清学方法存在着与其他病毒的交叉反应问题[9]。RT-PCR方法是一种快速敏感的检测方法[10-12]，在一定程度上解决了上述问题，但比荧光荧光定量RT-PCR其检测特异性、灵敏度及检测速度均稍逊一筹[13-15]。因此，建立WEEV的荧光定量RT-PCR检测方法就显的尤其重要。

本试验以WEEV E1基因为目标基因，应用MEGA5.0软件对其进行分析，筛选保守片段，制备标准品cRNA，设计引物及MGB探针，建立了WEEV的TaqMan MGB荧光定量RT-PCR方法。根据样本阈值循环数(Ct值)、产物荧光值、标准曲线斜率和相关系数等，对荧光定量RT-PCR反应体系进行了优化，最终确定循环数为45个循环，反应温度为60℃,引物浓度为400nmol/L，探针浓度为200nmol/L。用建立的荧光定量RT-PCR对EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、EEEV和WEEV阳性样本进行扩增，只有WEEV样本呈现扩增曲线，说明该方法特异性高，与其他马属动物病毒无交叉反应。将制备的cRNA标准品10倍稀释，进行扩增，当每个反应加入10拷贝的cRNA时可以稳定地检测到扩增信号，但当加入1拷贝的cRNA时，检测不到扩增信号。因此该方法的最低检测限为10拷贝。用普通RT-PCR可检测到103拷贝的cRNA，因此本试验建立的荧光定量RT-PCR方法的灵敏度是普通RT-PCR方法的100倍。将所建立的方法应用于临床检测，其与普通RT-PCR方法的检测结果一致。因近期血液样品保存较少，无法进行大量的临床应用，我们会在后期的日常检测中进行进一步的应用与验证。

综上所述，本试验建立了灵敏、快速、特异的WEEVTaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法，该方法在进出境动物检验检疫、流行病学调查及病原鉴定中具有重要的应用价值。

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Development ofTaqMan MGB Real-time PCR for Detection of Western Equine Encephalitis Virus

ZHENG Xiao-long,WANG Qun,DENG Ming-jun,ZHANG Xiao-wen,SUN Ming-jun,ZHU Lai-hua

(ShandongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao,Shandong,266002,China)

The 1317bp specific and consensus sequence of Western equine encephalitis virus (WEEV) was amplified by RT-PCR and cloned into plasmid pMD-20T,RNA was transcribedinvitrousing linearised plasmid DNA.Serial dilutions of cRNA were used as standard templates for real-time RT-PCR to quantify the genomic copy number of WEEV．We developed aTaqMan MGB real-time RT-PCR to detect WEEV.Sensitivity analysis showed that the developedTaqMan MGB real-time RT-PCR could detect 10copies/μL．The specificity assay exhibited that negative control and the other equine pathogens could not be detected.The result demonstrated a 100fold sensitivity of the real-time RT-PCR assay was developed compared with gel-based real-time RT-PCR method.

Western equine encephalitis virus;TaqMan MGB;real-time RT-PCR

2015-06-09

国家质检总局科技项目(2014IK240)

郑小龙(1979-)，男，山东平邑人，高级兽医师，硕士，主要从事进出境动物检疫研究。

S855.3

A

1007-5038(2016)01-0006-05