中药治疗对精子非整倍体率及辅助生殖结局的影响*

韩临晓 孙晓岩 陈 博 郑志涛 钟秋生 潘瑞华

东莞市第三人民医院生殖医学中心，广东东莞 523326



·临床研究·

中药治疗对精子非整倍体率及辅助生殖结局的影响*

韩临晓 孙晓岩 陈 博 郑志涛 钟秋生 潘瑞华

东莞市第三人民医院生殖医学中心，广东东莞 523326

目的 研究中药治疗对少弱畸形精子症患者的精子染色体非整倍体率及辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)结局的影响。方法 将58例要求接受ART的少弱畸形精子症患者随机分为试验组和对照组。试验组26例，采用生精汤治疗3个月后进行精子染色体分析，再接受辅助生殖治疗；对照组32例，直接进行辅助生殖治疗，2组均采用卵胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)受精方式，观察2组的受精率、卵裂率、优胚率、可用胚胎率、妊娠率及流产率。结果 治疗前，试验组和对照组的精子非整倍体率分别为2.3%和2.1%，差异无统计学意义。治疗后，试验组经复查，精子染色体非整倍体率为1.7%，与治疗前相比，差异有统计学意义(P<0.05)；试验组和对照组的受精率分别为82.55%和80.80%，卵裂率分别为99.25%和98.77%，优胚率分别为24.91%和24.07%，可用胚胎率分别为76.23%和70.68%，妊娠率分别为57.69%和31.25%，流产率分别为7.70%和12.50%，种植率分别为38.98%和22.20%，其中妊娠率和种植率2组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 中药治疗可降低精子染色体非整倍体率，改善辅助生殖技术的结局。

中药；精子染色体；非整倍体；辅助生殖技术；卵胞质内单精子显微注射

辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)的应用解决了少弱畸形精子症患者的生育问题，尤其是卵胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术的应用，ICSI技术越过受精过程中精子自然选择的过程，有可能将含有遗传缺陷的精子注射到卵母细胞内。有研究[1-3]表明，需行ICSI治疗的严重少弱畸形精子症患者的精子染色体非整倍体率明显升高。Aytoz[4]研究发现，经ICSI治疗的严重少弱畸形精子症患者，妊娠后胎儿宫内死亡率、稽留流产率较精液指标正常人群升高，其子代染色体非整倍体率升高。现代研究表明中药治疗可改善精液质量，其机制有促进睾丸生精功能、减少生精细胞凋亡、上调生精细胞中抑制凋亡基因Bcl-2的表达等，但中药治疗的同时能否降低精子染色体非整倍体率，目前尚无相关研究报道。本研究旨在探索中药治疗对精子染色体非整倍体率及ART结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2014年9月—2015年2月因男性不育因素来本中心拟行ICSI治疗的患者为研究对象，共58例。将患者随机分为试验组和对照组。试验组26例，配偶平均年龄(32.12±1.81)岁。对照组32例，配偶平均年龄(33.22±2.31)岁，2组间一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入标准

患者纳入标准如下：①以WHO精液质量诊断标准(第5版)为参考，精子浓度<15×106/ml，前向运动精子(PR)<32%，正常形态精子<4%；②符合肾虚证候表现，如精子数减少或活力差、精液量较少、伴有腰膝酸软、头晕耳鸣、精神疲惫、失眠健忘、舌淡苔白和脉沉细弱等。

排除因染色体异常、生殖道炎症、性激素异常、生殖道畸形等因素致不孕不育者。

1.3 治疗方法

试验组根据患者的症状与体征辨证用药，方剂生精汤由淫羊藿18 g，菟丝子12 g，覆盆子12 g，巴戟天12 g，五味子6 g，蛇床子6 g，车前子12 g，枸杞子12 g，石斛6 g，肉苁蓉10 g，熟地12 g，当归15 g等组成。水煎服，每日1剂，分早晚2次服用，30 d为1个疗程，3个疗程后再进行ART。对照组直接进行ART。对试验组患者的治疗前、治疗3个疗程后精子染色体进行FISH检测，并比较精子非整倍体率。试验组与对照组接受ICSI治疗后，比较2组患者的受精率、卵裂率、优胚率、可用胚胎率、妊娠率、种植率及流产率。

1.4 精子荧光原位杂交(FISH)检测方法

FISH检测方法步骤如下：①用密度梯度方法处理所有研究对象的精液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后离心，将精子沉淀，用3∶1甲醇/冰醋酸固定，调整精子浓度约为5×106/ml，―20 ℃冻存2 h，将精子固定液滴在玻片上风干；②将玻片置于2×柠檬酸钠缓冲液(SSC)中洗涤2次，3 min/次，1 mol/L NaOH作用4 min，70%、85%、100%乙醇梯度脱水，加入含13、18、21号、X和Y染色体着丝粒探针混合液后，盖上玻片用胶封口，放入FISH杂交仪72 ℃ 4 min，37 ℃ 16 h后，用0.4×柠檬酸钠缓冲液/0.3%壬基酚聚氧乙烯醚-40(0.4×SSC/0.3%NP-40)，73 ℃洗脱2 min，再用2.0×SSC/0.1%NP-40洗脱1 min，风干后加入DAPI，10 min后于荧光显微镜下观察并计数，每个标本计数1 000个精子；③荧光信号判读参照Munne标准，荧光亮度弱的信号不予计数，因其多为非特异性杂交信号，以1个信号的直径为1个域，2个同色信号距离很近或成对排列、相距在1个信号直径以内时计为1个信号，因其多为1条染色体的DNA复制形成的姐妹染色单体或信号分裂，当2个信号相距至少2个域以上时，则认为它们是2个不同的信号。

1.5 统计学处理

使用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，采用χ2检验进行统计分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组精子非整倍体率比较

治疗前，试验组和对照组的精子非整倍体率分别为2.3%和2.1%，差异无统计学意义。治疗后，试验组精子染色体非整倍体率为1.7%，比治疗前明显降低(P<0.05)。

2.2 2组ART结局分析比较

试验组和对照组的受精率分别为82.55%、80.80%，卵裂率分别为99.25%、98.77%，优胚率分别为24.91%、24.07%，可用胚胎率分别为76.23%、70.68%，妊娠率分别为57.69%、31.25%，流产率分别为7.70%、12.50%，种植率分别为38.98%、22.20%。其中妊娠率和种植率2组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组ART结局分析比较(例，%)

与对照组比较*P<0.05

3 讨论

本中心数据显示极度少弱畸形精子症患者行ICSI治疗后受精率、优胚率等较常规体外受精或其他指征ICSI的低，分析原因可能是患者精子染色体非整倍体率高。有学者[5]研究发现，与生育力和精液各参数均正常男性相比，畸形精子症患者18号、X和Y染色体非整倍体率明显升高。精液各参数与精子非整体率的相关性争议较多。Lewis-jones等[6]研究发现精子畸形与精子染色体异常有关，大头畸形、多尾畸形、双头畸形的精子染色体畸形率高达76%～100%。对这类患者进行ART要慎重。Rives等[7]研究发现，非整倍体率与精子活动率呈负相关，与精子的形态无关。导致这些矛盾结果可能有以下因素：①研究中应用的精液常规诊断标准不同；②可能精子非整倍体率与某些特殊类型的形态异常有关，如双头、大头、多尾精子等；③将弱精、少精、畸形精子症作为一个单独指标有困难，大部分患者存在弱精和(或)畸形精子症同时也有少精子症。

中药治疗男性精液异常有悠久历史。现代研究[8-11]表明，中药可通过调整附睾功能，促进α-糖苷酶分泌，提高精子活力和精子活率；中药具有雄激素样作用，能促进睾丸的生精功能，提高精子数量及活力；可提高血清中NO、LH和T水平，降低FSH水平，减少生精细胞的凋亡，对损伤的睾丸生精小管有较好的修复作用；可提高睾丸组织中SOD的活性，降低NOS活性及NO、MDA含量，清除睾丸中过量的氧自由基，同时上调生精细胞中抑制凋亡基因Bcl-2的表达。本观察基于现有研究及经验，配制生精汤，通过FISH技术检测精子染色体非整倍体，发现非整倍体率较治疗前降低，具体机制可能是通过改善睾丸及附睾内环境，从而减少精原细胞减数分裂中的错误，改善附睾转运分离不正常精子的作用。精子非整倍体率降低可使胚胎染色体异常发生率降低，从而提高胚胎质量，提高妊娠率。

中药调节精原细胞减数分裂的机制还需进一步研究，为极度少弱畸形精子症患者降低精子非整倍体率，从而改善辅助生殖结局。

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Influence of Chinese Medicine on the Rate of Sperm Aneuploidy and Assisted Reproductive Technology Result

HAN Linxiao，SUN Xiaoyan，CHEN Bo，et al

CenterofReproductiveMedicine，theThirdPeople'sHospitalofDongguan，Dongguan523326，China

Objective To study the influence of Chinese medicine on the rate of sperm aneuploidy and assisted reproductive technology(ART) result.Methods 58 infertile men with oligoasthenoterazoospermia who received ART treatment were divided into experimental group(26 cases)and control group(32 cases).The experimental group received ART treatment after 3 course of Chinese medicine.The control group received ART treatment directly.Fluorescence in situ hybridization(FISH)was used to analyze spermatozoa chromosomes.The rate of fertilization，the rate of cleavage，the rate of high embryo，he rate of useful embryo，the rate of pregnancy，the rate of abortion and the rate of implantation were observed and compared between two groups.Results Before treatment，the rate of sperm aneuploidy for experimental group and control group was 2.3% and 2.1% respectively，with no significant difference.After treatment，the rate of sperm aneuploidy for experimental group was 1.7% which was significant lower than before(P<0.05).For experimental group and control group，the rate of fertilization was 82.55%，80.80%，the rate of cleavage was 99.25%，98.77%，the rate of high embryo was 24.91%，24.07%，the rate of useful embryo was 76.23%，70.68%，the rate of pregnancy was 57.69%，31.25%，the rate of abortion was 7.70%，12.50%，the rate of implantation was 38.98%，22.20%.There was significant difference for the rate of pregnancy and implantation between two groups(bothP<0.05).Conclusion Chinese medicine can reduce the rate of sperm aneuploidy and improve ART result.

Chinese medicine；spermatozoa chromosome；aneuploidy；ART；ICSI

10.3969/j.issn.1674-4616.2016.05.001

*东莞市科技计划医疗卫生类科研一般项目(No.东科[2014]104号之232)

2016-03-25)